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摘 要：实时荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技术灵敏度高、特异性强，广泛用于肉制品中动物源性成分的定性、定量分析。已有多种基于RT-PCR技术的分析策略用于实现肉制品中动物源性成分的定量检测，已报道的定量分析策略各有优势及缺陷，目前尚无可推广的国家标准方法发布。本文针对采用RT-PCR技术对肉制品中动物源性成分定量检测的分析策略及其中的关键因素（结果表示形式、靶基因、DNA提取效率、DNA降解、扩增效率、标准物质、物种基因组大小）进行综述分析，为建立最优定量分析模型提供思路，期望找到操作简便、成本较低、可推广实施的定量分析策略，实现对肉制品中动物源性成分进行准确定量检测，促进国家标准检测方法的制定。
关键词：肉制品;动物源性成分;实时荧光聚合酶链式反应;定量分析策略;单拷贝基因
Abstract： Real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） has been widely used in species identification and quantification in meat products with high sensitivity and specificity. There are now several RT-PCR-based quantification strategies for animal-derived ingredients in meat products. Each has its own advantages and disadvantages. However， China does not currently have a national standard for this. In order to provide new ideas for developing an optimal quantitative model， this paper reviews and analyzes the RT-PCR-based quantification strategies and the key factors affecting them such as the form of expression of results， target genes， DNA extractability， DNA degradation， amplification efficiency， reference materials and genome size. This review will be useful for the development of an easy-to-operate， low-cost， widely applicable quantification strategy to help formulate a national standard based on RT-PCR assay.
Keywords： meat products; animal-derived ingredients; real-time polymerase chain reaction; quantification analysis strategy; signal-copy gene
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210220-041
中图分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2021）07-0044-06
引文格式：
马炳存， 崔学文， 李琰歆， 等. 基于实时荧光聚合酶链式反应技术定量检测肉制品中动物源性成分研究进展[J]. 肉类研究， 2021， 35（7）： 44-49. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210220-041. http：//www.rlyj.net.cn
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我国[1]及欧盟[2]食品标准均要求肉制品包装标签上应明确标识产品中动物源性成分组成及含量，但市场上肉制品中动物源性成分含量虚标、掺假事件屡禁不止[3]。
肉制品掺假给消费者身体健康（过敏反应）、宗教信仰等方面带来风险，同时严重影响社会诚信体系[4]。在肉制品掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分定性、定量鉴别技术的研究成为食品安全领域的研究热点[5-8]。
目前，動物源性成分鉴定分析方法主要基于蛋白质和DNA分析。基于蛋白质的分析技术包括免疫[9-10]、色谱[11]和质谱[12]。肉制品加工过程中的热处理工艺、酸碱盐环境变化使蛋白质变性，蛋白质生物活性丧失。基于蛋白质分析的肉制品动物源性成分鉴别技术很难满足实际检测的需要，且亲缘关系较近的物种蛋白质分析易出现交叉反应，限制了蛋白质分析技术在这一领域的应用。基于DNA分析的鉴别技术可以克服这些困难，DNA的热稳定性、酸碱稳定性优于蛋白质，并且DNA有更丰富的种间多态性，高温处理过的食品中仍能提取出片段化的DNA[13]，在深加工肉制品的鉴别检测中DNA分析方法具有灵敏度高和特异性强的明显优势[14]。基于DNA的定量分析技术主要包括数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术和实时荧光PCR技术。数字PCR技术不依赖标准曲线、不受扩增效率影响、PCR抑制较小，可以对动物源性成分靶标进行绝对定量分析，结果准确可靠，是实现肉制品中动物源性成分定量检测的理想工具。但该技术设备投入大、运行成本高、应用范围窄、技术人员不足，大量基层实验室未装备数字PCR技术平台。基于数字PCR的动物源性成分定量检测方法，短期内在肉制品国家监督抽检任务中很难大范围推广，不能为肉制品市场监管提供技术支撑。实时荧光PCR技术成熟稳定、成本低、应用范围广，几乎所有检验实验室都具备相应的技术平台和人员。开发基于实时荧光PCR技术的定量检测方法，有利于大范围推广实施，是当前技术背景下在肉制品监督抽检中发挥重要作用的最优解决方案。
目前，我国对动物源性成分的鉴定已有定性检验标准51 项，其中国家标准10 项、行业标准34 项、地方标准6 项、农业标准1 项，主要采用实时荧光PCR技术对DNA进行定性检测。现行标准中的检测方法主要存在以下局限性：第一，只能进行定性检测，无法完成定量分析;第二，检测灵敏度过高，在检测过程中，无法排除生产、贮藏、运输、销售等过程中样品交叉污染或原料带入造成的阳性结果[15-16]，很难为市场监管提供有力的技术支撑。
现行国家标准方法主要以线粒体基因作检测靶标，线粒体基因进化速度快，对物种的区分度较高，常用于物种的细致分类，研究生物的进化过程。但线粒体基因在不同物种或同一物种不同组织细胞中拷贝数差异显著[17-18]，针对线粒体DNA的检测方法多用于定性检测，很难完成定量分析。线粒体的拷贝数普遍较高，以线粒体基因为检测靶标导致检测灵敏度过高，无法区分产品交叉污染、原料带入和生产者恶意掺假造成的阳性检测结果。以细胞核中单拷贝基因作为检测靶标设计引物和探针，建立动物源性成分定量分析方法，可以克服现有定性检测方法的缺点。目前已报道的细胞核单拷贝基因定量检测靶标主要包括猪源性β-actin基因[19]、绵羊源性催乳素受体基因[20]、鸡源性TGF-BETA3基因[21]以及在哺乳动物和禽类中广泛存在的肌肉生长抑制素（Myostatin）基因[22]、F2基因[18]和LcoR基因[23]等。因此，建立基于实时荧光PCR技術对肉制品中动物源性成分进行定量检测的分析策略，准确鉴别肉制品掺假，为市场监管、执法检验提供可靠的技术支撑已迫在眉睫。
1 已报道的动物源性成分定量分析策略
1.1 基于线粒体DNA的定量策略
线粒体DNA具有较高的种间多样性和较低的种内变异，在细胞中拷贝数多，常用作肉制品中动物源性成分定量分析的检测靶标[24-25]。Hossain等[26]利用细胞色素b基因作为检测靶标，将纯猪肉样品的DNA作为标准物质，梯度稀释后构建标准曲线，对样品中猪源性DNA进行绝对定量检测，通过计算样品中猪源性DNA相对含量表示猪源性成分含量，其定量分析模型为p/%=a/t×100，其中p为肉制品猪源性成分含量（质量分数）/%，a为样品中猪源性DNA绝对含量/ng，t为样品总DNA含量/ng。这一定量模型用DNA相对含量表示样品中动物源性成分质量分数，利用实时荧光PCR技术对猪源性DNA进行定量检测，通过吸光度（A260 nm）法对样品总DNA进行定量测定，定量模型简单。猪源性DNA与样品总DNA的定量方法不同，引入的系统误差较大，导致定量结果不准确。Kim等[27]利用线粒体D-环区基因作为猪肉检测靶标，以18S rRNA作为内参基因检测靶标，对该定量模型进行了优化。以人工制备的不同猪肉含量（100%、50%、25%、5%、1%、0.1%）的标准样品DNA作为标准物质构建标准曲线，分别对猪肉靶基因和内参基因进行相对定量分析，通过计算二者的相对比例表示猪源性成分含量，其定量分析模型与Hossain等[26]的模型（p/%=a/t×100）相同，该定量策略采用靶基因和内参基因2 套标准曲线，分别对猪肉DNA和总DNA进行定量分析，降低了总DNA测量的误差，提高了定量结果准确度。
以线粒体DNA作为检测靶标进行定量分析，面临的最大挑战是线粒体DNA拷贝数的巨大差异[28]。Floren等[18]报道，同一组织中线粒体DNA和单拷贝DNA的拷贝数差距为100～1 000 倍，不同组织中线粒体DNA拷贝数差距达6 倍以上。在检测之前研究人员无法得知样品中具体的物种及组织细胞成分，无法对定量结果进行校正，导致基于线粒体DNA的定量策略定量结果不可靠，利用单拷贝基因作检测靶标可以消除线粒体DNA拷贝数变异引入的系统误差。
1.2 基于细胞核单拷贝基因的定量策略
细胞核单拷贝基因在每个细胞中拷贝数固定，可以消除因样品组分不同导致检测靶标拷贝数变化带来的误差，为准确定量分析动物源性成分奠定了基础。Laube等[29]2003年报道了基于牛细胞核单拷贝磷酸二酯酶基因（bosPDE）、猪细胞核单拷贝钙通道受体基因（susRY）及哺乳动物和禽类细胞核单拷贝内参基因（Myostatin）为靶标的动物源性成分检测方法。2007年，Laube等[13，30]利用前期开发的细胞核单拷贝基因，建立了以靶基因拷贝数占内参基因拷贝数的比例表示定量结果的分析模型：p/%=a/t×100，其中p为肉制品目标源性成分质量分数/%，a为样品中靶基因拷贝数，t为样品内参基因拷贝数。该模型校正了线粒体多拷贝基因拷贝数变化带来的系统误差，为动物源性成分准确定量提供了理论依据和技术基础。该模型用梯度稀释的DNA（ng/μL）作标准物质构建标准曲线，定量测定靶基因的拷贝数，但需要引入被检测物种的基因组大小这一参数完成DNA质量浓度向拷贝数的换算。由于不同物种基因组大小差异较大，导致定量结果差异较大。另外，该模型中基因拷贝数与样品质量分数之间未经过换算，直接以质量分数表示定量结果，进一步放大了结果误差。采用参考基质作标准物质构建标准曲线能够避免DNA质量浓度向拷贝数的换算，校正物种基因组大小差异引入的系统误差。
1.3 基于参考基质的定量策略
不同动物组织中细胞的含水量、体积等参数并不相同，相同质量的样品中DNA含量（拷贝数或浓度）差异较大。肉制品加工过程会造成DNA的大量降解，导致深加工肉制品与粗加工肉制品动物源性成分定量结果差异可达10 倍[13]。因此，以DNA含量构建标准曲线进行动物源性成分定量分析带来的问题是样品的质量分数与DNA含量之间无法准确换算[17]。为解决这一问题，Eugster等[31]建立了基于参考基质的定量分析模型：p/%=a/t×100，其中p为肉制品目标源性成分质量分数/%，a为样品中目标源性成分质量/g，t为样品总质量/g，该模型利用不同质量分数的系列样品作参考基质构建标准曲线，以特异性单拷贝靶基因和单拷贝内参基因作检测靶标，对目标源性成分的质量分数进行定量检测。该定量模型避免了DNA质量浓度向质量分数的转换计算，校正了因基质变化带来的系统误差，定量结果更准确，是近年来应用最广泛的定量分析策略[32-35]。然而，基于参考基质的定量策略需要制备市场上所有肉制品品种的标准参考基质，而且制备过程需要模拟待检样品的加工工艺，以保证标准参考基质的DNA含量和提取效率与待检样品一致，面对大量抽检样品时，可行性极差。在开发定量分析方法、确认方法学性能时，引入固定的校正系数可以解决参考基质变化引入的系统误差。
1.4 基于校正系数的定量策略
利用单拷贝特异性靶基因和内参基因进行动物源性成分定量检测时，含量为100%的纯阳性样品，特异性靶基因和内参基因的DNA理论含量相同。由于扩增引物、探针的不同以及扩增体系的差别，特异性靶基因和内参基因的定量结果并不总是完全一致，导致产生系统误差。Wang Wenjun等[23]通过引入校正系数来修正这一系统误差，使二者协调一致，建立了基于校正系数的定量分析模型：p/%=k×a/t×100，其中p为肉制品目标源性成分质量分数/%，a为样品中目标源性靶基因拷贝数，t为内参基因拷贝数，k为校正系数，k=1+（t100%-a100%）/a100%。
该模型利用含量为100%的纯阳性样品计算校正系数，将校正系数引入定量分析模型，校正了靶标扩增体系不同带来的系统误差。该模型测定的是DNA拷贝数，当以样品质量分数表示定量结果时，需要完成DNA拷贝数与质量分数之间的换算，这一换算过程需要研究人员明确知道待检样品中所有物种成分，这显然与定量检测目的相悖。通过人工合成单拷贝靶基因和内参基因，制备靶基因和内参基因含量相同的标准质粒，能够有效解决标准物质不宜获取的难题，同时保障了标准物质批间稳定性，大幅提高定量检测可行性。
2 定量分析策略的影响因素
2.1 结果表示形式
基于DNA分析的动物源性成分定量分析策略面临的首要问题是市场上肉制品种类复杂，不同品种肉制品在动物源性成分组成、加工方式、处理过程等方面各不相同，研究人员不可能获得肉制品原辅料组成及加工处理过程的全部信息，从而建立清晰、准确的定量分析模型。实时荧光PCR技术本质是对目标DNA含量（拷贝数或浓度）进行定量分析，若以质量分数表示最终定量结果，需要将DNA含量换算为样品质量分数，换算过程会引入样品动物源性成分组成、加工方式、处理过程等参数信息，很难准确换算，导致定量结果不准确。Ballin等[4]建议直接采用基因组当量（g/g）表示动物源性成分定量结果。但目前国内外法规均要求以质量分数标识肉制品动物源性成分含量，若以基因组当量表示定量结果具有较大阻力，肉制品生产企业也很难对产品中动物源性成分含量进行准确标识。
2.2 靶基因
定量靶基因的选择直接影响基于实时荧光PCR技术的动物源性成分定量分析结果准确性。固定拷贝数或单拷贝的靶基因比线粒体DNA等多拷贝基因更适合定量分析。Floren等[18]的研究数据表明，同一组织中线粒体DNA和单拷贝DNA的拷贝数差距为100～1 000 倍，不同组织中线粒体DNA拷贝数差距也高达6 倍以上。因此，采用细胞核单拷贝基因作为检测靶标可以建立更加准确的定量分析模型。
2.3 DNA提取效率
DNA提取效率不同物种的动物源性成分，其组织中脂肪、肌肉、筋膜含量不同。样品DNA提取过程中，不同的样品组分和DNA提取方法造成DNA提取效率差异较大。研究表明，鸡肝脏中DNA的提取效率是鸡胸肉的25 倍[36]，脂肪含量较低的猪内脏中DNA的提取效率明显高于高脂肪含量的其他组织[13]。Kang[37]分析实验室常用DNA提取方法对不同样品DNA提取效率的差异，认为商业化试剂盒提取样品DNA更加高效、方便。
2.4 DNA降解
肉制品的热加工工艺会导致样品中DNA大量降解，严重影响实时荧光PCR的定量分析结果。研究[13]表明，深加工肉制品和粗加工肉制品中动物源性成分定量結果差异显著。因此，在建立动物源性成分定量分析模型时应当充分考虑样品DNA降解造成的不利影响。可利用与待检样品加工方式相同的标准参考基质[31]构建标准曲线，或引入基质修正系数[38]来降低DNA降解造成的干扰。
2.5 扩增效率
基于实时荧光PCR技术的动物源性成分定量分析策略，不能直接对样品DNA进行定量，需要依赖标准曲线，将样品中靶基因循环阈值代入拟合方程计算靶基因含量。拟合计算过程要求待检样品DNA扩增效率与标准曲线扩增效率相同，且为95%～105%[39]。即使样品DNA经过严格的提取、纯化步骤，提取产物中始终含有基质带入的PCR抑制物[40]（如多糖、乙二胺四乙酸、钙离子、无机盐），降低样品DNA的扩增效率。尤其是待检样品与参考基质在成分组成、加工工艺不同时，扩增效率引入的误差更加突出。Pfaffl[41]研究结果表明，参考基质与样品DNA的扩增效率有5%的差异，经过30 次PCR循环后，会带入113%的系统误差。
2.6 DNA含量测定
实时荧光PCR技术定量过程需要绘制标准曲线，但尚无定量准确的标准品。分光光度法（A260 nm）最常用于总DNA含量测定，但分光光度法对单链DNA更敏感，且受DNA提取过程中带入的苯酚、氯仿干扰较大，对DNA含量的测定结果不够准确[42-43]。受DNA提取效率的影响，提取的总DNA含量与样品的基质类型密切相关，深加工肉制品由于样品DNA大量降解，样品中总DNA含量较少，受分光光度法的影响更大[44-45]。
2.7 物种基因组大小
采用分光光度法测定样品总DNA含量，若以g/g表示定量结果，需要带入物种基因组大小计算基因组当量。但不同物种基因组大小差异显著，基因组当量不易准确计算。例如，牛基因组大小是鸡基因组的3 倍[13]，牛肉样品中掺假鸡肉，牛源性成分含量被高估，导致定量分析结果不准确。要消除物种基因组大小引入的误差，需要预先知道待检样品中动物源性成分组成，查询对应的物种基因组大小，准确计算DNA拷贝数，这与定量检测目的矛盾。因此，在定量分析模型中引入物种基因组大小这一参数，将大大降低定量方法的实用性。
3 结 语
肉制品中动物源性成分定量检测准确度要求高，影响因素较多，研究内容复杂，基于DNA分析的定量分析模型构建困难。数字PCR技术[18-19]能够对动物源性成分进行绝对定量检测，不依赖标准曲线、不受扩增效率影响、PCR抑制干扰较小。但基于数字PCR的定量分析策略依然受结果表示形式、靶基因选择、DNA提取效率、DNA降解、物种基因组大小等因素影响，在构建定量分析模型时应充分考虑上述参数，保证定量结果准确可靠。通过构建标准质粒、引入校正系数等方案设计，基于实时荧光PCR技术的定量分析策略同样能够实现动物源性成分的准确定量，与数字PCR技术相比，实时荧光PCR技术具有成熟稳定、成本较低、仪器平台广泛、易于推广实施等优势，在保障肉制品质量安全方面更加适用。但已报道的定量分析方法存在以下不足，严重限制了这些方法的推广应用：第一，用于定量的靶基因拷贝数与样品质量分数之间的对应关系无法准确计算;第二，以质量分数表示样品中定量结果时要求DNA提取效率接近100%，但由于不同肉制品动物源性成分、加工工艺、原辅料不同，DNA提取效率很难达到100%;第三，定量过程需要构建标准曲线，但无法获得定量准确的标准品。
不同物種、组织、细胞的含水量、密度并不相同，相同质量的样品其DNA含量差异显著，将质量分数引入定量模型极大降低了定量结果的准确性。基于实时荧光PCR技术的准确定量分析策略，应以基因组当量（g/g）或细胞数含量（cell/cell，c/c）代替质量分数表示定量结果，将实时荧光PCR定量数据与质量分数区分;以细胞核固定拷贝或单拷贝基因作检测靶标，可以消除拷贝数变异引入的系统误差;采用参考基质作标准物质构建标准曲线能够避免DNA质量浓度向拷贝数的换算;确认方法学性能时，提高DNA提取效率，优化PCR扩增体系，引入固定的校正系数解决参考基质变化引入的系统误差;通过人工合成单拷贝靶基因和内参基因，制备靶基因和内参基因含量相同的标准质粒，能够有效解决标准物质不宜获取的难题，同时保障了标准物质批间稳定性，大幅提高定量检测可行性。同时，我国应当推进肉制品动物源性成分定量分析策略的开发，尽快建立肉制品动物源性成分定量分析方法，有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为监督抽检、市场监管提供可靠的技术支撑和准确的肉制品评价体系。
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