大白菜EST-SSR标记开发中非SSR标记的鉴别

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　　摘要：EST－SSR标记开发过程中经常会遇到一些问题，例如引物重复设计等。本试验对从大白菜EST序列中开发的30个多态性SSR标记产生的多态性条带进行测序，结果发现有一些标记的多态性并不是由于其所含有的简单重复序列重复次数的改变引起的，这类标记约占鉴定标记总数的13％。这些标记实际上属于EST－SCAR标记。在进行SSR变异对基因表达及功能影响方面的研究时。这类非SSR标记应该被排除。
　　关键词：EST－SSR；标记开发；多态性；测序；大白菜
　　中图分类号：S634.1；Q503　文献标识号：A　文章编号：1001－4942(2010)04－0001－04
　　
　　简单重复序列(simple sequenee Repeats，SsR8)，又称微卫星(microsateuite)序列，因其具有多态性高、稳定性好、易于操作、呈共显性以及遍布整个基因组等特点而成为非常理想的遗传标记。近些年来，由于许多作物的大量EST序列得以测序，这为利用EsT序列开发新的遗传标记包括EsT－SSR提供了基础。利用公共数据库中大量的EST序列开发SSR等标记，免去了传统的从基因组中开发标记时需要的克隆、测序等步骤，对开发标记而言具有省时、省力、费用低等特点。所开发出的引物由于来自于功能基因区，该区域在近缘物种中相对保守，因而具有良好的可转移性，可以用于比较基因组学等研究。在评价作物种质资源多样性时，人们更希望能了解资源材料中功能基因的多样性。来自功能基因区的EST－SSR标记，其多态性往往低于非功能基因区的genomic－SSR标记，这被认为是基因功能限制了SSR变异的结果，因而人们认为EST－SSR标记是一种功能性的遗传标记，EST－SSR提供了良好的功能基因多样性评价的工具。正因为EST－SSR标记具有上述特点，目前人们已经在许多作物中开发了很多EST－SSR标记。
　　在实际开发EST－SSR标记的工作中常常会遇到一些问题，如引物重复设计、扩增产物含内含子、引物跨越内含子与外显子界限、EST序列质量低等等，这些问题可以通过适当的方法得以解决。我们在开发大白菜EST－SSR引物过程中遇到的另一个现实问题是开发出的EST－SSR引物扩增出的多态性并不是由SSR位点简单重复次数改变所引起的。这一点常常为人们所忽视，但在利用这些引物进行功能基因多样性评价或进行SSR位点变异对基因表达及功能影响等方面的研究时，这又是客观的不应该忽视的问题。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1，1试验材料及DNA提取
　　开发引物多态性验证所用的材料为山东省农业科学院蔬菜研究所收集保存的大白菜自交系及地方品种共8个。分别为：白引1号、白引2号、胶州白菜、掖县猪嘴、李楼中纹、福山包头、河头早、黑56。
　　苗期采用常规的CTAB法提取各大白菜自交系及地方品种的DNA。
　　1.2　EST序列来源以及片段置叠群(config)构建及引物设计
　　从NCBI公共数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)中下载到大白菜EST序列147 217个。对这些序列参照葛佳等的方法进行前期处理，包括除去EST序列中存在的载体序列polyT(5’端)和pdyA(3’端)序列、含有歧义碱基(ambiguous bases)的序列、小于100 bp的序列。然后利用SeqMan程序(Lasergene软件包，DNAStar Inc.)对处理后的EST序列进行重叠群(configs)构建。用MISA软件(http：//WWW.pgrc.ipk－gateleben.de/misa)在构建的重叠群中筛选SSR标记，标准参见Zhang等。对筛选到含SSR的重叠群用Primer Premier 5.0(http：//www.PremierBiosoft.com)软件设计引物。
　　
　　1.3　SSR标记多态性检测
　　设计的SSR引物在上海生工合成，溶解后稀释成2 μmol/L备用。PCR采用20μl反应体系：40 ng模板DNA，1×PCR buffer(含20 mmol/LMgcl2)，200 μmol/L NTP8，引物0.1 μmol/L，1 uTaqDNA聚合酶。扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1min，共计35个循环；72℃延伸lO min。4~C 10min终止反应。PCR产物经6％聚丙烯酰氨凝胶电泳后银染检测。
　　
　　1.4　多态性条带的回收及测序
　　切下凝胶板上各材料间呈多态性的条带，置入10μl超纯水中95℃加热5 min，冷却，短暂离心后上清液稀释10倍进行二次PCR扩增，PCR产物回收后用TA克隆载体(天根生化有限公司)，克隆后在诺塞基因公司测序。每个条带各做一次重复。测序结果用MEGA4.0软件进行比对分析。
　　
　　
　　2　结果与分析
　　
　　2.1　EST－SSR引物的设计及多态性检测
　　对147 217个大白菜EST序列经过处理和拼接后得到31 519个重叠群序列。从其中4 000个重叠群序列中发现了1145个SSR位点。对其中400个SSR位点设计了引物，其中230个可在大白菜8个材料中获得清晰的扩增条带，105个在8个材料中显示出多态性。引物BREl44是一对多态性引物，根据重叠群contigl335设计，扩增区域含有8个二碱基Tc重复，其上游引物序列为：5’－AAACCTrrCCGTATAATGTC－3’，下游引物序列为5’－TGCTGATrCTrCTFGCTFC－3’，在大白菜8个自交系及地方品种中的扩增产物电泳后的结果见图1。
　　
　　2.2　多态性条带测序结果
　　为了检测多态性引物扩增的多态性条带的大小，我们对30对多态性引物扩增的多态性条带进行了回收，二次PCR后进行了克隆与测序。测序结果表明，所有引物扩增的均为目的片段，其大小也在目标大小范围内，重复间无差异。有26对引物的多态性是由SSR重复基序重复次数的改变引起的，另有4对引物(BRE48、BRE58、BREl44、BREl48)在不同材料间的多态性并不是由重复基序重复次数的改变引起的，而是由重复基序以外的碱基的插入与缺失引起的。BREl44对白引1号和河头早的扩增条带以及该引物所在重叠群序列的比对结果见图2。
　　
　　3　讨论与结论
　　
　　引物BREl44对大白菜8份材料共扩增出两个等位变异，呈明显的多态性(图1)。但对多态性条带的测序结果显示，简单重复序列(TC)n的重复次数在两个等位变异中均无改变，都重复8次。但在第44～57位，河头早明显比白引1号多出14个碱基，在其它4个位置即第35、第8l～83、第116～117和第142～144位两个序列间也存在碱基的插入缺失现象(图2)。正是这些碱基的插入缺失突变造成了不同材料间的多态性。其它3对引物BRE48、BRE58、BREl48和BREl44情况相似，即这些引物在不同大白菜材料间扩增的多态性均是由SSR位点以外的碱基的插入缺失突变引起。这类引物大约占鉴定的30对多态性引物总数的13％。
　　
　　碱基的替代、插入缺失、片断重复是基因组进化过程中最常见的序列变异类型。EST序列来自功能基因，相对于基因组非基因区的序列，保守性较强，但并非绝对保守，尤其是在3’与5’端的非编码区。EST－SSR标记的开发正是以EST序列中SSR变异为基础的。EST序列中的其它变异例如碱基的替代、插入缺失等也常被用于开发EST－ShIP和EST－RFLP以及EST－SCAR等标记。本试验经过测序表明在开发EST－SSR引物的过程中，所设计的BRE48、BRE58、BRE144和BRE148四个标记的多态性并不是由SSR的变异引起，因此它们实际上是属于EST－SCAR标记，而不是EST－SSR标记。虽然这四个标记经测序证明不属于SSR标记，但因其在大白菜不同品种中具有多态性，因此并不影响它们作为分子标记用于辅助育种、多样性评价等项研究。
　　有实验证据表明，EST序列中的SSR对基因的表达调控及基因的功能有着重要的影响，例如烟草花粉特异表达基因ntp303 5’－UTR区中的(GAA)s SSR位点通过形成stem－loop结构而对mRNA的翻译效率起着重要的调节作用，当缺失掉这8个GAA重复后，融合基因荧光素酶的表达量比对照降低了94％。有人认为EST－SSR的多样性影响到基因的功能，有必要对呈多态性的EST－SSR的变异与基因功能的改变及对基因表达的影响之间的关系进行研究，这对阐明基因功能的进化也是非常有意义的。进行这项研究前提是要鉴定出真正存在的SSR变异，本文提到的四个标记虽然都含有SSR，但事实证明在不同材料中出现的变异不是由于这些SSR变异引起的。因此这四个标记显然不适合进行这方面的研究。因此我们建议在进行EST－SSR变异对基因功能影响方面研究时对引物扩增出的多态性条带进行测序以鉴定出真正的EST－SSR标记。
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