3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立

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　　摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。
　　关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立
　　中图分类号R155.5文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)23-0324-02
　　
　　沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。
　　为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　供试菌种为沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌,均购自山东省疾病预防控制中心,接种到营养肉汤中制成标准菌液,36 ℃增菌培养。检测样品:肉类、蛋类和奶类食品是沙门氏菌的主要感染源,从济南市各超市及农贸市场选择购齐这3类食品样品,共计56份,分别为生鸡蛋、加工包装的熟鸡蛋、生猪肉、生鸡肉、袋装新鲜牛奶、烤肠、酱肉等几类。对这些样品分别采用新建的PCR方法和传统培养法进行检测,并对检测结果进行比较。
　　1.2主要试剂及仪器设备
　　PCR反应试剂盒为大连宝生物工程有限公司生产的TaKaRa产品,细菌培养用显色培养基为法国科玛嘉(郑州博赛生物技术研究所)产品,增菌培养基为北京陆桥生物技术有限公司生产。核酸DNA制备:细菌基因组的提取使用的是天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒,操作步骤按照提取试剂盒说明进行。主要仪器设备:Basic Panoramic型均质器(西班牙IUL),DeltaDilutor型精密电子稀释器(西班牙IUL),S1000TM Thermal Cycler PCR反应仪(美国BioRad公司),DYCZ-20A型DNA序列分析电泳仪(北京市六一仪器厂)。
　　1.3PCR引物的设计与合成
　　从GenBank中获取各种不同来源地沙门氏菌的invA基因序列,应用PrimerExpress软件分析基因序列,根据引物设计原则,在这些序列的保守区域筛选到能扩增目标片段长度为198 bp的1对引物,委托北京博尚生物有限公司合成,其序列如下:
　　上游引物:5′-GTGGGGTTTGTTGTCTTTT-3′
　　下游引物:5′-CTCTTTCCAGTTCGCTTCG-3′
　　进行PCR扩增PCR反应体系为:模板DNA 1.0 μL、10 μmoL/L上下游引物各0.5 μL、2 mmoL/L dNTP 2.0 μL、2.5 U/μL Taq酶0.2 μL、25 mmoL/L Mg2+ 2.0 μL、10 倍缓冲液2.0 μL、补DEPC 水至25 μL。循环参数为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性50 s;56 ℃退火50 s;72 ℃延长20 s;30个循环;72 ℃再延长10 min。产物鉴定:扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶上电泳,经EB染色后,紫外灯下观察。
　　2结果与分析
　　2.1新建PCR检测方法的特异性
　　设计的PCR检测方法应具有能从复杂样品中特异性地扩增目标片段的能力,因此选择合适的用于扩增检测的基因是保证检测方法特异性的关键。本试验选择了沙门氏菌的invA基因,扩增片段为198 bp,具有良好的种特异性。对沙门氏菌标准菌株及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等4种相关细菌标准菌株进行检测,电泳图谱见图1。新建方法中除沙门氏菌出现了明显条带外,其他菌株均不见特异性扩增条带,表明本试验建立的PCR检测方法对沙门氏菌具有很好的特异性,与其他相关肠道细菌无交叉反应。
　　2.2新建PCR检测方法的灵敏性
　　以无菌操作将沙门氏菌标准菌种的纯培养液充分混匀,按10倍递增逐级稀释,自10-1稀释度浓度至10-8稀释度浓度,然后分别取10-8~10-3稀释度浓度的各不同梯度稀释液提取核酸DNA,按新建PCR方法进行沙门氏菌检测,电泳结果见图2。从图2可以看出,最低可以检测的菌液的稀释数量级是107倍。另外,分别将10-8~10-5这4个浓度的纯培养液各取0.1 mL,划线接种沙门氏菌科马嘉选择性平板,培养后计数菌落数目。通过计算可知沙门氏菌标准菌种纯培养液中细菌浓度为7.2×108 cfu/mL。由此可知,纯培养的检测极限为72个细菌浓度。
　　2.3食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立
　　将从市场上购买来的3类共计56份样品,分别接种沙门氏菌增菌液增菌培养,从中选择3种样品人工感染沙门氏菌,检测过程分别采用新建的PCR方法和传统培养法进行平行试验,将2种检测方法进行比较,进而评价该新建PCR方法。检测试验结果表明,对于已知感染沙门氏菌的5份样品,2种检测方法均检测出阳性,对剩余的51份样品,新建PCR方法检测有3份为沙门氏菌阳性,传统培养法也检出该3份样品为沙门氏菌阳性。2种检测方法检测阳性样品结果完全一致,符合率为100%。
　　本试验利用传统培养法检测对新建PCR方法进行鉴定,通过对实际样品的检测,表明该方法对于沙门氏菌阳性样品未存在漏检,同时对于阴性样品也未出现假阳性结果,说明该新建PCR方法检测特异性较高。另外,本试验新建PCR检测方法从制备样品到得出最终检测结果只需要30 h左右,待检测样品增菌完毕,取增菌液提取DNA后即可直接用于PCR扩增反应,2 h后即得检测结果,大大缩短了检测时间。
　　3结论与讨论
　　沙门氏菌菌型繁多,几乎所有的沙门氏菌都会污染食物引起发病,是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。某些菌株还存在不同程度的耐药性,对人类的健康构成很大的潜在威胁。长期以来,人们对于沙门氏菌的检测几乎一致依赖于传统的检测方法,即选择性或非选择性增菌、可疑细菌分离、生化反应和血清学鉴定等常规方法。这些方法虽然经典、准确、可靠,但检验方法繁琐、步骤复杂、所需要的检测试剂繁多,费时费力,整个检验过程至少需要4~7 d才能完成,对于检测样品量少时还能应付,但不能满足大宗样品和快速检测的需要。因此,传统培养法在快速、敏感与特异性等方面具有自身的局限性。
　　本试验利用新建PCR方法对3类共计56份实际样品进行检测,通过与传统培养法检测结果进行比较,2种检测方法检测阳性样品结果完全一致,符合率为100%。另外,本试验新建PCR检测方法从制备样品到得出最终检测结果只需要30 h左右,待检测样品增菌完毕,取增菌液提取DNA后即可直接用于PCR扩增反应,2 h后即得检测结果,大大缩短了检测时间。
　　4参考文献
　　[1] 尹荣焕,尹荣兰,杨玉英,等.PCR技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究[J].安徽农业科学,2006,34(2):222,226.
　　[2] 刘斌,史贤明.扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用[J].微生物学通报,2006,33(2):156-161.
　　[3] 向雪菲,刘斌,张利达,等.食品中沙门氏菌分子检测靶点的筛选与评价[J].微生物学报,2008,48(7):941-946.
　　[4] 刘胜贵,魏麟.应用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌的研究[J].食品科学,2007,28(3):254-256.
　　[5] RAHN K,DE GRAND SA,CLARRKE RC,et al.Amplification of an invA gene sequence os Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella [J].Mol Cell Probes,1992, 6(4):271-279.
　　[6] COHEN H J,MECHANDA S M,LIN W,et al.PCR amplification of the fimA gene sequence of Salmonella typhimurium,a specific method for detection of Salmonella[J].Applied and Environmental Microbiology,1996, 62(12):4303-4308.
　　[7] 卢强,陈贵连,林万明.PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌[J].中国兽医学报,1994,14(3):251-256.

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