重组犬α干扰素急性毒性试验研究

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　　摘要为观察小鼠体内重组犬α干扰素急性毒性反应,进行重组犬α干扰素临床安全用药试验。结果表明:在连续观察14 d内,各组小鼠外部表现及行为特征均正常,体温和体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液生化指标检查;注射1.0×106IU/只雌性小鼠ALT为(85.2±5.2)U/L,较正常对照组高,其他各组生化指标与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。可见,该试验设定的最高剂量1.0×106IU/只及其以下剂量对小白鼠均无明显毒性作用,在临床上应用该重组犬α干扰素是安全的。
　　关键词重组犬α干扰素;急性毒性实验;小鼠
　　中图分类号S859.8文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)14-0286-02
　　
　　ExperimertalResearchonActuteToxicityofMicewithRecombinantCanineIFN-α
　　LUO Chang-min 1ZHAO Jun 2TANG Ren-shu 2LI Jing-pei 2HU Yong 2WANG Yan-lai 2WANG Ming-li 2 *
　　(1 Immunology Teaching and Research Section,Anhui Medical University,Hefei Anhui 230032; 2 Microbiology Teaching and Resarch Section,Anhui Medical Umiversity)
　　AbstractAcute toxicity in mice with recombinant canine IFN-α in vivo was studied in order to provide a basis for clinical drug safety. The results showed that:during 14 days of continuous observations,the external performance and behavioral characteristics of mice in each group were normal,the changes of body temperature and weight were within normal range,pathological anatomy of internal organs had no organ lesions,bloodbiochemical examination; ALT in female mice after being injected by 1.0×106 IU every mouse was(85.2±5.2)U/L,more than the normal control group,other groups had no significant differences from the normal control group(P>0.05). This experiment set the maximum dose 1.0×106 IU for a mouse and the below dose had no apparent toxic effects on mouse. It was prompted that the application of recombinant canine IFN-α in the clinical was safe.
　　Key wordsrecombinant canine IFN-α;acute toxicity;mouse
　　
　　近年来,养犬业在中国发展迅速,犬作为伴侣动物已成为人们生活的一部分,但犬细小病毒、犬瘟热等病毒病严重危害着犬类的健康与生存,同时犬所携带的一些人兽共患病原体也严重危害人类的健康。在现代社会犬病毒病的预防和治疗显得尤为重要。干扰素(interferon,IFN)是病毒感染诱导机体产生的一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的蛋白质,主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤的活性。干扰素对动物病毒性疾病具有较好的防治效果[1-3]。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同,分为α、β、γ3类。α型干扰素在体内外能发挥广谱、高效抗病毒作用,其机制是抑制病毒蛋白质的合成,并能选择性地作用于受感染细胞,而对正常宿主细胞无作用或作用微弱,使用后无任何药物残留。最早应用于兽医临床的是白细胞干扰素(IFN)。但该种IFN在体内表达量低,需采用生化分离的方法获得,成本高,很难进行规模化生产。但基因工程技术的发展使干扰素实现规模化生产[4-7],干扰素也越来越广泛的被用于动物疾病的治疗。
　　自2000年以来,安徽医科大学免疫学教研室应兽用市场的需求,开始进行动物重组α干扰素研发工作,分别获得3项国家发明专利(专利号:200410065926.5、200410065929.9、200510038332.X),并正在实审3项专利(申请专利号:2006 10041237.X、200610041239.9、2008100201804)。但是,应用于动物疾病治疗的IFN必须是无毒无害的。因此,进行重组犬α干扰素的安全性试验是非常必要的。现将研究结果报告如下。
　　1材料与方法
　　1.1试验动物
　　Balb/c小鼠:选择健康体重为18～20 g的小白鼠,共计80只,随机分为4组,每组20只,雌雄各半,由安徽医科大学动物实验中心提供。
　　1.2给药剂量与途径
　　1.2.1重组犬α干扰素纯化制品。安徽医科大学免疫学教研室该室自行制备(详见专利:2006100 41237.X),效价为1.0×106 IU/mL。
　　1.2.2急性毒性试验。实验组小白鼠80只,雌雄各半,体重(20±2)g,腹腔注射,分A、B和C 3个组,每组20只;同时设正常对照20只。干扰素剂量:A组1.0×106IU/只;B组1.0×105IU/只;C组1.0×104IU/只,给药后连续观察14 d。检查是否死亡,观察各种毒性反应症状以及记录体重。对每只动物仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。从动物体重、体温、血管指征、眼睑指征、呼吸指征、运动指征、皮肤(包括毛色)、胃肠指征、肌张力、死亡时间、死亡症状等方面进行观察。在试验结束时,取鼠血进行血液学和体内生化指标的测定。
　　1.3统计学处理
　　用SPSS 13.0软件对试验数据进行录入统计,结果以均数(x)±标准差(S)表示,2组间比较用t检验,P<0.01为有统计学显著差异。
　　2结果与分析
　　2.1行为特征观察
　　在整个试验过程中,小白鼠无一例死亡。试验前后各组小白鼠的行为特征无变化。小白鼠爪、尾呈正常肉红色,无糜烂红肿,行动活跃。毛色正常,无脱毛现象,无小便失禁,触之反应灵敏。
　　2.2体重观察
　　由表1可见,各试验组小鼠体重与对照组相似,即体重变化比较平缓,稍有上升趋势,与对照组相比,无显著性差异。
　　2.3体温观察
　　给药后的体温变化与对照组相似,即各组小白鼠体温都在正常的36~38 ℃内波动,没有异常的偏高或偏低体温,属于正常的波动范围。
　　2.4组织病理观察
　　试验结束后,对各组小鼠进行解剖,结果显示与对照组情况无明显差异,心、肺、肝、脾、肠、胃、肾上腺、胰脏、卵巢和睾丸等重要脏器肉眼和镜下观察均未见有意义的中毒性病变。
　　2.5血液学检查
　　给药14 d后,处死鼠样前取血测血液学指标。各组血液学指标和对照组相比无显著性差异(P>0.05)。
　　2.6体内生化指标检查
　　给药14 d后,处死前取血进行血液生化指标的检查,A组雌性小鼠ALT为(85.2±5.2)U/L,较正常对照组高,其他各组生化指标与对照组相比无显著性差异(P>0.05)(表2)。
　　3讨论
　　目前,对畜禽类传染病的预防和治疗主要是通过疫苗接种和使用抗生素。但是由于养殖环境恶劣、病毒变异以及机体抵抗力下降等原因,大部分抗生素类药物以及传统的口服类抗病毒药物出现药物残留等问题,给人类健康带来负面影响,该类药物已面临全面叫停状态;由于传统的疫苗的高度特异性,常常难以应对病毒变异和新型病毒的出现给畜禽养殖业带来的巨大危害[8-12]。在这种缺乏动物药品的状况下,很多动物疾病都在使用人类药物,而“人药前移”后,人类使用时将明显降低药物敏感性。因此,积极研制抗禽、畜病毒病新型药物将是人类最为关注的问题。
　　干扰素具有良好的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能,被认为是当今应用前景最为广阔的生物制剂之一[13]。其疗效已被各国学者所公认,目前全球有60多个国家和地区应用人干扰素制剂治疗大约30多种病毒性疾病。相对而言,动物干扰素的研究滞后很多,目前主要停留在基础研究和临床试验阶段。最早应用于兽医临床的是白细胞干扰素,但该种干扰素在体内表达量低,半衰期短,需采用生化分离的方法,获得成本高,很难进行规模化生产。基因工程技术的发展为干扰素大量生产提供新的方向。但总的来说,干扰素在国内畜牧业生产上的研究及应用均很少,理论方面也大多借鉴人类干扰素的研究,因此畜禽类干扰素在基础理论和实践应用上仍需要进行大量的研究。
　　本试验是在已研发成熟的重组犬α干扰素基础上,对其进行急性毒性实验,以期为临床使用提供试验依据。在对小白鼠注射重组犬α干扰素后,结果表明,其外部及行为特征正常,体温、体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液生化指标的检查,A组雌性小鼠ALT为(85.2±5.2)U/L,较正常对照组高,其他各组生化指标与对照组相比无显著性差异。可以认为重组犬α干扰素对试验动物没有明显毒性作用,使用是安全的。该试验过程中最大剂量在按千克体重计算时,相当于对犬正常施用剂量的1 000倍。根据以上试验结果,可以认为重组犬α干扰素比临床剂量大1 000倍时对小白鼠不具有急性毒性作用,这一结果为该重组犬α干扰素临床安全使用进一步提供试验依据。
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