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[摘 要] 琼脂糖凝胶电泳技术是基因工程实验课程教学中必不可少的一项常规教学内容。琼脂糖凝胶电泳技术常用的核酸染料EB具有强烈的致突变能力和强致癌性。而核酸染料Genefinder属于花青类植物染料，毒性很低，使用安全，可有效保护实验操作者和环境，且检测核酸的灵敏度高。论述在基因工程实验平台建设中应用无毒的核酸染料Genefinder替代强致癌的EB作为基因工程琼脂糖凝胶电泳中的核酸染料，阐述核酸染料Genefinder实施于在基因工程本科实验教学中的应用及成效，并对完善核酸染料Genefinder在基因工程实验课教学中的应用提出思考。
[关键词] Genefinder;基因工程;实验教学;实验平台建设;实践与思考
[基金项目] 2021年度广西壮族自治区教育厅，广西学位与研究生教育改革课题“研究生核心课程‘系统生物学与生物信息学’建设研究与实践”（JGY2021134）;2019年度桂林医学院校级教学改革项目“对分课堂在生物信息学教学改革中的应用探索与研究”
[作者简介] 王小燕（1983—），女，江西上饶人，硕士，桂林医学院生物技术学院实验师，主要从事分子生物学研究;林 军（1977—），男，广西桂林人，博士，桂林医学院生物技术学院副教授，主要从事医药生物技术研究。
[中图分类号] G642.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-9324（2021）30-0128-04 [收稿日期] 2021-04-13
一、引言
基因工程（Genetic Engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是指在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作[1] （P3-6）。理论知识具有抽象、丰富、零碎、更新快等特点，学生不易理解和掌握[2]。琼脂糖凝胶电泳技术是基因工程相关实验课程中必不可少的一项常规技术。荧光染料溴化乙啶（Ethidium Bromide，EB）是一种常规的核酸染料，被广泛应用于观察、检测琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中的DNA或RNA，具有简单、快速、灵敏度高的特点[3]。然而EB具有强烈的致突变能力和强致癌性，可插入相邻碱基平面之间，引起基因突变，对实验者和周围环境都有很大的危害[3-5]。一直以来，桂林医学院生物技术学院的基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验教学采用EB染液浸泡的方法染色，由于EB除了剧毒性特点，还具有挥发性，同时对实验场地也造成严重污染，需要设置专门的染色场地，需要对染液、染液杠及相关用品并做后续专门处理，这不仅对实验师生的身体带来危害，同时也使实验教学成本增加，给实验教学准备工作带来更大的工作量。
核酸染料Genefinder是作为EB的替代品的一种新型染料。与强致癌的EB不同，Genefinder属于花青类染料，毒性很低，使用安全，可有效保护实验操作者和环境。研究表明，GeneFinder与dsDNA结合荧光信号可增强800～1000倍，检测核酸的灵敏度是EB染色法的10倍左右，与美国Molecular Probe公司的SYBR Green I染料的灵敏度相当[6-8]。鉴于此，该研究在桂林医学院生物技术学院2018级和2019级生物技术本科基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验教学课程中用核酸染料Genefinder替代EB染料，取得良好的效果。
二、核酸染料Genefinder在基因工程實验教学平台建设中的应用
该研究通过比较预染法（10ul核酸染料Genefinder加入1ml 6×loading buffer混匀，每5ul DNA样本加入1ul加有染料的6×loading buffer，130V稳压电泳半小时）、染料直接加入凝胶法（10ul核酸染料Genefinder/100ml琼脂糖凝胶、1ul核酸染料Genefinder/100ml琼脂糖凝胶、0.5ul核酸染料Genefinder/100ml琼脂糖凝胶）、后染法 （100ml TBE加入10ul核酸染料Genefinder原液，电泳后直接将胶块泡30min）三种核酸染料Genefinder使用方法，并对使用浓度和使用条件进行反复摸索，最终得到在基因工程琼脂糖凝胶电泳中使用核酸染料Genefinder的最佳实验条件。该研究使用的核酸样品为多个公司的DMaker2000。该研究使用的核酸染料Genefinder是上海迪奥生物科技公司产品，它属于花青素类染料，最大吸收峰是470nm，在可见光范围。核酸染料Genefinder产品原液为10000×，原液用DMSO溶解。使用的6xloading buffer（上海生工），DNA Maker DL2000（上海生工;爱德森）。该研究实验结果显示，相较于在琼脂糖凝胶中直接加入EB染料，直接在琼脂糖凝胶中加入核酸染料Genefinder效果更好，在浓度梯度实验中，1ul核酸染料Genefinder/100ml琼脂糖凝胶这个浓度效果最好，每个品牌的Maker2000的每个条带都很清晰漂亮。而预染法结果中所有品牌的Maker2000中的100bp和200bp小片段条带都看不到，重新用EB进行染色之后可见。采用核酸染料Genefinder后染法结果显示条带不如采用EB后染法清晰。因此，该研究选用直接100ml琼脂糖凝胶中加入1ul核酸染料Genefinder的方法应用于桂林医学院生物技术学院的基因工程本科实验教学平台建设中，并首先应用于2018级和2019级生物技术本科基因工程琼脂糖凝胶电泳所有相关实验课程教学中。
三、核酸染料Genefinder在基因工程实验教学课程中的应用
该研究团队在桂林医学院生物技术学院2018级和2019级生物技术本科的基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验课程中应用核酸染料Genefinder（100ml琼脂糖凝胶中加入1ul核酸染料Genefinder），整个琼脂糖凝胶电泳相关实验课程在桂林医学院生物技术学院分子生物学实验室中进行。实验室内配置了多套电泳仪、电泳槽、混匀仪、离心机等基因工程相关设备以及DNA提取、RNA提取、质粒提取、酶切以及琼脂糖凝胶电泳相关实验试剂和用品。在上课前的准备阶段，需要根据上课的班级建好实验小组，同学们也先行修习过相关的基因工程理论课程，然后教师将设计好的实验步骤发到各个实验小组的同学中，同时建议同学们查找一些相关的实验资料。基因工程实验是理论和实践结合紧密的一门课程，学生在实验课中动手操作项目较多。在动手操作前对所要操作的内容一无所知会影响实验操作，因此，高水准的预习是实验成功的第一步。根据以往学生反馈，文字版的实验原理较抽象、不易理解，所以任课教师将实验原理以小视频、GIF动图形式呈现，方便学生理解。在课堂教学阶段，上课后教师会分析教学任务，在实验过程中以学生为主体，教师在实验课上进行指导，配合学生完成实验，以便学生在实验过程中发现并解决问题。针对学生的实验结果，任课教师拿出往届在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验教学课程应用EB染料时的实验结果，与这次在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验课程中应用Genefinder染料的实验结果做对比分析，然后在不同小组内进行讨论，最后根据讨论结果让不同小组同学在给定的时间内完成本次实验报告。基因工程实验结果最终以实验报告的形式呈现，实验报告是对实验的总结。学生在写实验报告的过程中对所做的实验进行回顾，通过精修图片、查阅文献，按发表论文的要求撰写实验报告，培养学生处理实验数据、撰写高质量文章的能力。对不同组遇到的问题，教师需要适度地解释和引导，而不是完全帮助解决和完成教学任务。在整个实验教学过程中，要循序渐进，争取达到最好的教学效果。在实验教学任务完成后，教师要根据不同小组的实验完成情况，给予分析、点评和总结。上课的同学都希望自己完成的实验任务得到肯定，对于完成实验教学任务较好的同学要给予表扬，对于完成实验教学任务不太好的同学也要给予鼓励和关注，直到这部分同学也能独立、完整地完成全部实验教学任务。
四、核酸染料Genefinder在基因工程实验课程教学中的效果
经过不断实践，修改教学大纲、精选实验项目、合理安排实验操作流程和上课时间，核酸染料Genefinder在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验教学中取得了明显的教学效果。为评价Genefinder染料在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验课程教学中的效果，该研究组对在基因工程实验课程中应用核酸染料Genefinder的2018级和2019级生物技术本科同学对在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验教学中应用核酸染料Genefinder的满意度进行问卷调查，并对调查结果进行数据分析。同时，该研究组也对承担基因工程实验教学任务的任课教师对该染料的使用效果和该课程的教学情况等进行问卷调查和数据分析。根据调查结果，100%的学生对这种安全简单易行的基因工程实验平台表示“满意”，其中95%的同学“非常满意”。100%的任课教师认可核酸染料Genefinder在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验课程教学中效果，普遍认为核酸染料Genefinder在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验课程教学中的应用效果较之前在琼脂糖凝胶电泳中使用EB染料效果好。更重要的是最受师生欢迎的是使用无毒的核酸染料Genefinder替代强致癌的剧毒EB，让师生在实验教学中从之前的步步小心防护到现在放心大胆操作，心底的安全感油然而生。因为使用无毒核酸染料Genefinder替代强致癌的剧毒EB可以大大提高实验操作者和环境的安全，不再像以前在琼脂糖凝胶电泳中使用EB染料那样，每位同学在进入EB室前需要做好各种防护，并且之前的实验程序中，EB室所有实验相关用品在实验后都必须送危化品相关管理部门做特殊处理。在琼脂糖凝胶电泳中使用核酸染料Genefinder不需要像以前在琼脂糖凝胶电泳中使用EB染料那样需要专门的EB染色教室，所有的实验操作步骤只需在基因工程实验课教室中就能完成，大大方便了学生的实验操作，也节约了基因工程实验教学时间和成本。以上结果都表明，核酸染料Genefinder在基因工程琼脂糖凝胶电泳相关实验课程教学中应用，相较于之前使用EB染料具有明显的优势，对完善基因工程实验教学平台建设具有重要意义。
五、完善核酸染料Genefinder在基因工程实验课程教学中应用的思考
基因工程是一门实验性特别强的学科，而琼脂糖凝胶电泳又是基因工程实验课程中必不可少的一项常规技术。使学生在安全的环境下学习基因工程相关实验知识是在基因工程实验课程应用核酸染料Genefinder替代EB的初衷，核酸染料Genefinder在基因工程瓊脂糖凝胶电泳中的应用效果也得到学生和任课教师的普遍认可，受到教师和学生的广泛欢迎，总体教学效果良好。不过，在实验教学实践中也发现一些值得思考和研究的问题：一是课程教学需要在专门的实验室中实施，需要专门的实验设备，对学时的要求要更连贯。二是有的同学对核酸染料Gene finder使用知识掌握不够，实验操作思路不够清晰。学生如果思路不清晰，容易手忙脚乱，在实验过程中出错，任课教师在实验教学过程中要有更多的引导和示范。如何在实验过程中帮助学生理清实验思路、安排好实验过程，需要任课教师有较高的协调、组织能力。三是基因工程实验由于实验条件限制，是以小组的形式完成的，各组同学实验效果存在差异，在实验教学实施过程中需要各组同学进行更多的讨论和协商。如何调动起所有小组成员的积极性也是一个值得关注的问题。每一个课程设计都有阶段性，但教学改革永远没有终点。每一位教师应对教学改革不断探索和追求，永远在路上。
参考文献
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[2]许崇波.《基因工程》课程教学改革初探[J].大连大学学报，2005，26（6）：41-43.
[3]Lunn G.， Sansone E.B. Ethidium Bromide： Destruction and Decontamination of Solutions[J].Anal Biochem，1987，162（2）：453-458.
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On the Application and Thinking of Genefinder in the Experiment Teaching Reform： The Application and Thinking of Genefinder in the Experiment Teaching of Gene Engineering
WANG Xiao-yan， LIN Jun
（College of Biotechnology， Guilin Medical College， Guilin， Guangxi 541199， China）
Abstract： Agarose gel electrophoresis technology is an essential teaching content in genetic engineering experiment course teaching. EB， a common nucleic acid dye used in agarose gel electrophoresis， has strong mutagenicity and carcinogenicity. Genefinder is an anthocyanin plant dye with low toxicity， which is safe to use， and can effectively protect the experiment operators and the environment， and it has high sensitivity for nucleic acid detection. Therefore， This study describes the construction of an experiment platform for genetic engineering using the non-toxic nucleic acid dye Genefinder instead of the highly carcinogenic EB as a nucleic acid dye in agarose gel electrophoresis. Moreover， this study describes the application and effect of nucleic acid dye Genefinder applied to the undergraduate experiment teaching of genetic engineering. In addition， this study puts forward some thoughts on the improvement of the application of nucleic acid dye Genefinder in the teaching of genetic engineering experiment courses.
Key words： Genefinder; genetic engineering; experiment teaching; experiment platform construction; practice and thinking
