不同亚型的大肠侧向发育型肿瘤的KRAS、APC、p53表达

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　　[摘要]目的 比较不同亚型的大肠侧向发育型腫瘤（LST）、≥10 mm隆起型腺瘤、进展期大肠癌的KRAS、APC、p53的基因表达情况，探讨不同亚型LST的分子发生途径。方法 应用高分辨率溶解曲线法（HRM）分别检测2016年1月～2018年7月我院收治的38例颗粒型LST（LST-G）和13例非颗粒型LST（LST-NG）以及60例隆起型腺瘤、48例进展期大肠癌的KRAS、APC、p53的基因表达情况，应用统计学方法比较四组病变的基因表达差异。结果 LST-G，LST-NG，隆起型腺瘤、进展期大肠癌的KRAS、APC、p53突变率分别为52.6%、7.7%、46.7%和60.4%，15.8%、53.8%、20.0%和58.3%，7.9%、46.2%、11.7%和66.7%。LST-NG组KRAS突变率均低于LST-G组、隆起型腺瘤组和进展期大肠癌组，差异有统计学意义（P<0.05），而LST-G组和隆起型腺瘤组KRAS突变率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；LST-NG组APC和p53突变率高于LST-G组和隆起型腺瘤组，差异有统计学意义（P<0.05），而LST-G组和隆起型腺瘤组APC和p53突变率比较，差异无统计学意义（P>0.05），LST-NG组的APC和p53突变率低于进展期大肠癌组，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论 LST-G和LST-NG的基因表达不同，2种不同亚型的LST可能存在不同的分子发生途径。
　　[关键词]大肠侧向发育型肿瘤；亚型；高分辨率溶解曲线法；分子发生机制
　　[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0060-03
　　Expression of KRAS， APC and p53 in different subtypes of laterally spreading tumors
　　ZHONG Xuan-fang HUANG Wen-feng LIU Yu-hui
　　Department of Gastroenterology， Huizhou First People′s Hospital， Guangdong Province， Huizhou 516001， China.
　　[Abstract] Objective To compare the gene expression of KRAS， APC and p53 in different subtypes of colorectal lateral developmental tumors （LST）， polypoid colorectal adenomas （≥10 mm） and advanced colorectal cancer， and to investigate the molecular pathogenesis of the different subtypes of colorectal lateral developmental tumors. Methods The gene expression of KRAS， APC and p53 in our hospital from January 2016 to July 2018， 38 cases of granular categories （LST-G）， 13 cases of nongranular categories（LST-NG）， 60 cases of polypoid colorectal adenomas and 48 cases of advanced colorectal cancer were detected by High Resolution Melting（HRM）. Results The mutation rate of KRAS， APC and p53 in LST-G group， LST-NG group， polypoid adenoma group and colorectal cancer group were 52.6%， 7.7%， 46.7%and 60.4%， 15.8%； 53.8%， 20.0% and 58.3%， 7.9%， 46.2%， 11.7%， and 6.7% respectively. The KRAS mutation rate of LST-NG group were significantly lower than LST-G group， polypoid adenomas group and advanced colorectal cancer group respectively（P<0.05）. But there was no significant difference between LST-G group and polypoid adenomas group （P>0.05）. The APC and p53 mutation rate of LST-NG group were significantly higher than LST-G and polypoid adenomas group （P<0.05）， whereas the APC and p53 mutation rate were no significant difference between LST-G group and polypoid adenomas group （P>0.05）， the APC and p53 mutation rate in LST-NG group were lower than the advanced colorectal cancer group， but there were no statistically significant difference （P>0.05）. Conclusion The differences of gene expression between LST-G and LST-NG may remind the different molecular pathways. 　　[Key words] Laterally spreading tumor； Subtype； High Resolution Melting； Molecular pathogenesis
　　大肠侧向发育型肿瘤（LST）是一类起源于大肠黏膜的平坦隆起型病变，因与大肠癌关系密切受到重视[1]。LST形态多样，内镜下分为多种不同亚型，与隆起型息肉比具有独特的病变形态、生长方式和生物学行为[2-3]。目前国内外对LST的研究主要集中在与隆起型肿瘤的比较上，很少关于不同亚型LST间的基因表达情况的研究[4-5]。本研究通过比较不同亚型的LST、隆起型腺瘤、进展期大肠癌的KRAS、APC、p53的基因表达情况，初步探讨不同亚型的LST的分子发生途径与隆起型腺瘤的差异，现报道如下
　　1资料与方法
　　1.1 一般资料
　　选取我院2016年1月～2018年7月经内镜或外科手术切除的所有LST标本51例，根据内镜下形态是否呈颗粒集簇样改变分为颗粒型（LST-G）38例和非颗粒型（LST-NG）13例；同时收取同期经内镜切除的直径≥10 mm隆起型腺瘤标本60例和经手术切除的进展期大肠腺癌标本48例，根据疾病的类型分为4组。所有患者术前均未接受任何放疗或化疗，并排除炎症性肠病、家族性腺瘤性息肉病和遗传性非息肉病性大肠癌、非原发癌灶患者。所有标本均有完整的临床和病理资料（表1）。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者在检查及治疗前均签署知情同意书。
　　1.2 研究方法
　　1.2.1 主要试剂和仪器 Genomic DNA Extraction Kit购自日本Takara公司，HRM分析试剂盒购自北京天根公司，HRM检测采用全自动实时荧光定量PCR系统Light Cycler 480 System。
　　1.2.2 DNA的提取 按Takara说明书提供的操作流程提取DNA，并保存在-20℃冰箱中。提取DNA的浓度和纯度测定均用Nano Drop ND.1000分光光度计检测，DNA质量经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　1.2.3 PCR-HRM分析 根据KAS、APC、p53基因序列使用Primer Premier 5.00软件设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR扩增和HRM在Light Cycler 480 System一个反应中完成，所有反应均可重复进行。使用Gene Scanning Software分析HRM的数据。同时从组织DNA标本中扩增出KAS、APC、p53基因片段，由上海生工生物工程股份有限公司进行直接测序，检测KAS、APC、p53基因突变发生的具体位点和碱基变化。
　　1.3统计学方法
　　采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理，基因频率采用直接计数法，各组间率的比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1四组基因表达情况的比较
　　LST-NG组的KRAS突变率均低于LST-G组和隆起型腺瘤组、进展期大肠癌组，差异有统计学意义（P<0.05），LST-G组和隆起型腺瘤组KRAS突变率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；LST-NG组的APC和p53突变率高于LST-G组和隆起型腺瘤组，差异有统计学意义（P<0.05），LST-G组和隆起型腺瘤组APC和p53突变率比较，差异无统计学意义（P>0.05），LST-NG组的APC和p53突变率低于进展期大肠癌组，但差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。
　　2.2基因测序结果
　　用HRM法检测发现突变的KRAS、APC、p53基因与基因测序结果一致率为100%，34号标本KRAS-3基因测序结果，箭头所示为突变位点（图1，见封四）。
　　3讨论
　　约有2/3的散发性大肠癌的发生遵循传统腺瘤途徑，通常表现为隆起型息肉样外观，KRAS、APC和p53被认为是大肠癌发生发展的重要癌基因和抑癌基因[6]。另外平坦型肿瘤被认为与传统隆起型腺瘤的癌发生途径不同，缘于它们有不同的基因和遗传学表型突变[7]。LST是一类特殊类型的平坦型肿瘤，内镜下形态多样，亚型众多，主要分为颗粒型和非颗粒型，其中颗粒型又再分为颗粒均一型和结节混合型，而非颗粒型分为平坦型和假凹陷型[8]。最近的研究提示LST可能存在不同的分子癌变发生途径，各亚型遵循的癌变途径可能不同，前期的研究也提示不同形态的LST可能存在不同的基因调控机制[9-10]。
　　本研究在前期研究的基础上采用HRM法进一步检测不同亚型的LST的癌基因和抑癌基因表达情况，结果提示KRAS突变率在LST-G和隆起型腺瘤比LST-NG明显增高，提示KRAS信号途径激活可能参与LST-G的发生发展，与文献报道一致。文献报道KRAS突变率在LST-G和LST-NG分别是70%（30/43）和26%（13/50），提示KRAS参与的RTK/RAS突变信号途径在LST-G比LST-NG更常出现[11]。KRAS基因为癌基因，主要参与大肠癌发生的早期，Sugimoto等[12]检测了50例隆起型肿瘤，35例LST-G和19例LST-NG的KRAS突变率分别为30.0%，54.3%，21.1%，进一步通过多因素分析表明不同形态的LST与KRAS突变率显著相关，提示KRAS参与的信号激活途径可能对LST-G发生发展起更重要的作用，间接提示LST-NG的发生发展可能存在其他不同的途径。
　　APC基因为抑癌基因，主要在wnt信号通路中起关键的抑制作用，是大肠癌发生的早期事件。Shi等[13]报道Wnt/β-catenin/c-myc途径激活与LST的发生和恶变密切相关，Sugimoto等[12]报道LST-NG的wnt-beta连环蛋白信号途径中APC基因突变为主要因素，本研究结果提示APC基因突变在LST-NG比LST-G和隆起型腺瘤高，提示APC基因参与的wnt-beta连环蛋白信号途径可能与LST-NG发生发展有更密切的联系，与文献报道一致。 　　p53基因在进展性腺瘤发展成腺癌的过程中起关键作用，主要发生在大肠癌的晚期阶段。本研究结果提示，LST-NG p53突变率较LST-G高，与文献报道一致。Nagai等[14]报道p53在LST-G的阳性率比LST-NG低，提示LST-NG与LST-G不同，前者更有类似于癌的表型特征。Sakai等[15]通过多因素分析表明p53突变为LST恶变独立危险因素，提示LST-NG可能较LST-G的恶性潜能高，LST-NG更易发生黏膜下浸润。
　　综上所述，目前大肠癌发生途径仍不明确，LST形态多样，不同亚型可能遵循不同的分子发生途径，或者说形态上相似的大肠肿瘤或许仍然存在两种或更多种不同的分子发生机制，值得进一步研究。
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　　（收稿日期：2019-02-18 本文編辑：崔建中）
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