氯虫苯甲酰胺拌种处理对不同生育期水稻生化物质的影响

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　　摘要：为明确杀虫剂胁迫下水稻体内生化物质的變化，探讨生化物质变化对水稻感抗虫性的影响，本研究分析比较了不同用量氯虫苯甲酰胺拌种处理后，各生育期水稻叶片可溶性糖、类黄酮游离氨基酸和草酸的含量变化。结果表明，不同用量氯虫苯甲酰胺拌种处理后，水稻不同生育期叶片游离氨基酸含量与对照相比无显著差异，苗期和4叶1心期叶片可溶性糖含量与对照相比无显著差异，但1.5～2.0g/kg氯虫苯甲酰胺处理的水稻在分蘖期叶片可溶性糖含量显著增加。当氯虫苯甲酰胺有效用量为1.0～1.5g/kg时，水稻各生育期叶片类黄酮含量显著增加，苗期和4叶I心期的草酸含量显著增加，而在分蘖期除1.5g/kg处理的草酸含量显著增加外，其他处理与对照相比无显著差异。因此，推测氯虫苯甲酰胺拌种处理促进了水稻叶片类黄酮和草酸的增加，提高水稻不同生育期对稻纵卷叶螟的抗性，从而减少靶标害虫对水稻的为害。
　　关键词：氯虫苯甲酰胺;种子处理;生化物质;抗性
　　中图分类号：S473;S511
　　文献标识码：A
　　文章编号：1000-4440（2019）02-0289-06
　　氯虫苯甲酰胺是杜邦公司主导研究与开发的具有广谱性的化学药剂，是一种全新的邻酰胺基苯甲酰胺类杀虫剂。氯虫苯甲酰胺对多种农业害虫，如鳞翅目鞘翅目、半翅目、双翅目等具有优异的防治效果，特别是在水稻生产上，对鳞翅目害虫防治效果好，安全系数高，对非靶标节肢动物（如稻田蜘蛛）具有较高的安全性，对哺乳动物、鱼类和鸟类等的毒性极低。近年来，该药已大面积应用于水稻害虫的综合治理中。但是，长期的化学农药投入也带来了很多负面影响，如环境的污染，害虫抗药性引发的问题，收获作物上农药的残留，对非靶标生物的伤害等。有研究结果表明，药剂可以诱导植物体内生理生化物质发生变化，产生害虫感虫性现象。如利用吡虫啉井冈霉素、杀虫双、三唑磷和某些除草剂处理水稻植株，导致植株体内有利于害虫取食的可溶性糖和氨基酸含量显著提高，同时可导致植株体内不利于害虫取食的草酸含量下降，影响水稻的光合作用速率，而且水稻不同品种之间存在差异。农药在对病虫害进行防治的同时，也会改变植株体内营养物质的含量，增加对害虫的吸引力，从而间接引起害虫再猖獗的现象[5]。因此，化学防治给农药的使用提出了新的问题。许多杀虫剂和杀菌剂对作物的生理、生长产量有负效应。不同农药的影响机制也不同，有的对害虫有促进作用，有的则有抑制作用。有研究发现，药剂处理改变了植株的营养物质，有利于害虫取食繁殖，诱导感虫性。
　　本试验拟通过测定不同浓度氯虫苯甲酰胺拌种处理后，水稻叶片内与害虫生长发育有关系的营养物（可溶性糖、游离氨基酸），以及不利于害虫发生的次生代谢物质（草酸、类黄酮）含量的变化，进一步探讨药剂拌种处理对水稻叶片内生化物质的影响，以期为生产上利用氯虫苯甲酰胺拌种处理可持续治理稻纵卷叶螟提供科学依据。
　　 1 材料与方法.
　　 1.1 供试水稻及药剂
　　水稻品种为江苏地区大面积推广种植的迟熟中粳品种宁粳4号（南京农业大学农学院选育）。将不同浓度氯虫苯甲酰胺处理的水稻种子播在60emx100emx200cm的水泥池中，每个水泥池分为4小块。供试药剂为20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂（杜邦公司产品）。
　　 1.2 验设计
　　氯虫苯甲酰胺的有效用量为0g/kg、0.5g/kg、1.0gkg、1.5g/kg、2.0g/kg。
　　 1.3 种子处理
　　称取500g水稻种子置于网袋中，清水浸种48h后沥干，按试验需要称取20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂，按照最终药液质量与种子质量比为1：25的比例添加清水，同时加入红色指示剂进行拌种，混合均匀。将种子与不同浓度的氯虫苯甲酰胺拌种液同时倒入一次性加厚塑料袋中，快速翻动混匀，使种子与药液充分接触，待整个袋子中种子呈现均匀红色，平铺于纸上阴干，然后正常播种。
　　 1.4 测试指标
　　当水稻种子播种后长至苗期（17d）、4叶1心期（26d）和分蘖期（36d）时，用剪刀剪取水稻叶片，然后测定其叶片可溶性糖、游离氨基酸、草酸和类黄酮的含量。
　　 1.4.1 可溶性糖含量可溶性糖含量的测试参照张治安等的蒽酮法，略有改变。称取烘干的水稻叶片0.3g，放入大试管中，加入10.0ml蒸馏水，沸水浴20min后取出冷却，用滤纸过滤至25.0ml的容量瓶中，再用蒸馏水冲洗残渣几次，最后定容。吸取0.5ml提取液于试管中，加入蒸馏水1.5ml，先后向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂（1g蒽酮溶于50.0ml乙酸乙酯）和5.0ml浓硫酸，充分振荡，立即沸水浴加热5min，然后冷却至室温，以空白为对照，用酶标仪（伯腾仪器有限公司产品）在620nm吸收波长下测定吸光值。用蔗糖建立标准曲线，计算各样品中可溶性糖含量。各处理和对照均设3个重复。
　　可溶性糖含量（mg/g）=（C，xV，Xn）/（W.Xa，X1000）式中，C：标准曲线求得糖量（μg）;V：提取液量（ml）;a;：吸取样品液体积（ml）;n：稀释倍数;W：组织质量（g）。
　　 1.4.2 类黄酮含量类黄酮含量的测量参照耿敬章[5]方法，略有改进。剪下待测的水稻组织擦拭干净，放入烘箱中80C烘12h，再用粉碎机进行粉碎，用50目筛筛选一次，准确称取1g干粉放入离心管中，加入10ml60%乙醇溶液，混匀后将离心管置于70C条件下进行超声波处理，超声波功率保持350W，超声时间30min，3000r/min离心5min。同一样品按照上述方法重复操作2次。将离心后的上清液转移到25ml的容量瓶中，用60%乙醇溶液定容。混匀后吸取定容的提取液1ml于25ml容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1ml，摇匀后静止6min，再加入10%的A1（NO3）;溶液1ml，摇匀后静止6min。随后加入4%的NaOH10ml，再加入30%的乙醇溶液定容，摇匀后静置15min，用722型分光光度计在吸收波长500nm处测吸光值。用芦丁建立标准曲线，计算各样品中类黄酮含量。各处理和对照均设4个重复。 　　类黄酮含量（mg/g）=（C2Xn2）/（W2x1000）式中，C2：标准曲线求得芦丁量（μg）;n2：总稀释倍数;W2：组织质量（g）。
　　 1.4.3 游离氨基酸含量游离氨基酸含量的测定参照张宪政[16]的茚三酮法，略有改变。剪取新鲜的水稻叶片0.2g，加入10.0%乙酸溶液5.0ml，放入研钵中碾碎研磨至糊状，将过滤液转移至100.0ml的容量瓶中，用无氨蒸馏水定容。吸取提取液1.0ml，放入25.0ml容量瓶中，加入3.5ml的茚三酮缓冲显色液，再加入0.1%的抗坏血酸溶液0.1ml，摇匀后置于沸水浴中处理，显色20min，待冷却后加入10.0ml80.0%乙醇溶液，加水定容至25.0ml，用酶标仪在波长570nm处测定吸光值。用谷氨酸建立标准曲线，计算各处理和对照样品中游离氨基酸的含量。各处理和对照均设3个重复。
　　游离氨基酸含量（mg/g）=（C3xng）/（W.x1000）
　　式中，C3：标准曲线求得的游离氨基酸量（μg）;nz：总稀释倍数;W3：组织质量（g）。
　　 1.4.4 草酸含量测定水稻中草酸含量参照何春燕等[17]的三氯化钛比色法，略有改变。剪取水稻叶片1g，将其剪碎后充分研磨，用超纯水10ml冲洗至50ml的三角瓶中，加入约1/3体积的活性炭，摇匀后放置30min脱色，脱色后于4C条件下3000r/min离心15min分离活性炭，一次脱色不充分时可多次脱色，直至溶液无色或略呈乳白色。取上清液3ml，加入3%的三氯化钛（用10%稀盐酸配制）240μl，然后用酶标仪在波长为400nm处测定吸光值。用草酸（分析纯）建立标准曲线，计算各样品中的草酸含量。各处理和对照均设3个重复。
　　草酸含量（mg/g）=（C4xn4）/（W.x1000）
　　式中，C：标准曲线求得的草酸量（μg）;ng：总稀释倍数;W4：组织质量（g）。
　　 1.5 数据分析
　　利用单因素方差分析法分析不同处理和不同生育期水稻叶片内可溶性糖类黄酮、游离氨基酸及草酸的含量。所有数据采用DPS软件分析系统进行处理[18]，所有数据均未经转换。
　　 2 结果与分析
　　 2.1 不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理对各生育期水稻叶片可溶性糖含量的影响
　　图1显示，不同有效用量氯虫苯甲胺拌种处理后，苗期和4叶1心期水稻叶片可溶糖含量与对照相比均无显著差异（苗期：F=2.2，df=4，14，P=0.1500;4叶1心期：F=3.2，df=4，14，P=0.0600）。在水稻分蘖期，1.5g/kg和2.0g/kg氯虫苯甲酰胺拌种处理与对照相比，叶片的可溶性糖含量显著增加，分别增加了17.5%和30.9%（分蘖期：F=19.4，df=4，14，P=0.0001）。
　　 2.2 不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理对各生育期水稻叶片类黄酮含量的影响
　　图2显示，不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理会影响水稻不同生育期叶片的类黄酮含量（苗期：F=7.0，df=4，19，P=0.0022;4叶1心期：F=7.6，df=4，19，P=0.0015;分藥期：F=47.0，df=4，19，P=0.0001）。0.5g/kg、1.0g/kg和1.5g/kg氯虫苯甲酰胺分别拌种处理后，水稻苗期叶片类黄酮含量与对照相比分别增加了54%、47%和40%。1.0g/kg.1.5g/kg和2.0g/kg氯虫苯甲酰胺分别拌种处理后，水稻4叶1心期叶片类黄酮含量与对照相比分别增加了44%..40%和11%，水稻分蘖期叶片类黄酮含量与对照相比分别增加了69%、84%和46%。
　　 2.3 不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理对各生育期水稻叶片游离氨基酸含量的影响
　　图3显示，不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理后，水稻不同生育期叶片游离氨基酸含量与对照相比无显著差异（苗期：F'=0.79，df=4，14，P=0.60;4叶1心期：F=1.10，df=4，14，P=0.40;分蘖期：F=3.10，df=4，14，P=0.07）。
　　 2.4 不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理对各生育期水稻叶片草酸含量的影响
　　图4显示，不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理会影响不同生育期水稻叶片草酸含量（苗期：F=10.6，df=4，14，P=0.0013;4叶1心期：F=27.2，df=4，14，P=0.0001;分蘖期：F=10.3，df=4，14，P=0.0014）。1.0g/kg.1.5g/kg和2.0g/kg氯虫苯甲酰胺分别拌种处理后，水稻苗期叶片草酸含量与对照相比分别增加了110%、107%和87%，水稻4叶1心期叶片草酸含量与对照相比分别增加了143%、135%和115%，水稻分蘖期，1.5g/kg氯虫苯甲酰胺拌种处理后水稻叶片草酸含量与对照相比增加了47%，其他用量处理与对照比无显著差异。
　　 3 讨论
　　农药胁迫下，水稻植株體内生理生化物质会发生变化，诱导水稻对褐飞虱（561920）、稻纵卷叶螟、三化螟等害虫的感虫性。本研究结果表明，在水稻苗期和4叶1心期，不同用量的氯虫苯甲酰胺拌种处理不会显著影响水稻叶片可溶性糖含量，但在分蘖期，氯虫苯甲酰胺用量为1.5～2.0g/kg时，水稻叶片可溶性糖含量显著高于对照。糖是各种生物体内重要的营养物质之一，可为生物活动提供必要的能量，也可以转化为另外2种重要的营养物质（蛋白质和脂肪）。可溶性糖含量升高可以提高植物自身的抗性水平，增加植株对害虫的抗性，如水稻植株经硅肥诱导后，可溶性糖含量显著提高，水稻对稻纵卷叶螟的抗性得到增强。但也有研究结果表明，水稻植株内糖含量越高，越利于害虫的发生。本研究中，用1.5g/kg和2.0g/kg的氯虫苯甲酰胺拌种处理后，水稻分蘖期可溶性糖含量显著升高，而该条件下可溶性糖的升高对水稻抗虫能力的影响还需进一步验证和研究。 　　类黄酮是植物体内自身合成的重要次生代谢产物，以结合态或自由态存在，能提高植物的抗胁迫能力[28]，同时也是一种抗虫次生物质，害虫取食后会产生忌避或拒食反应，甚至中毒[29]。用500μg/ml类黄酮溶液涂抹水稻叶片，对褐飞虱雌成虫产生明显的拒食和忌避产卵作用[30]。本研究结果表明，当氯虫苯甲酰胺有效用量为1.0～1.5g/kg时，与对照相比，水稻各生育期叶片类黄酮含量显著增加，有利于提高水稻对稻纵卷叶螟的抗性。水稻中游离氨基酸含量与对靶标害虫的抗性之间有重要的联系13132）。有研究结果表明，游离氨基酸含量与稻纵卷叶螟的发生程度呈正相关。本研究结果表明，采用不同有效用量氯虫苯甲酰胺拌种处理后，在水稻的苗期、4叶1心期及分蘖期叶片游离氨基酸含量无显著变化，对稻纵卷叶螟的发生无促进作用。
　　草酸是生物体的一种代谢产物，普遍存在于植物界中（33。从水稻叶鞘中提取出的草酸能有效抑制褐～飞虱的取食，感虫和抗虫品种水稻中草酸含量与水稻对褐飞虱的抗性呈显著对应关系[34]。本研.究结果表明，在4叶1心期，1.0～2.0g/kg氯虫苯甲酰胺拌种处理后，水稻叶片草酸含量与对照相比显著增加。1.5g/kg氯虫苯甲酰胺拌种处理后，水稻分蘗期叶片草酸含量与对照相比显著增加。草酸含量的增加有利于提高水稻植株对稻纵卷叶螟的抗性，减轻稻纵卷叶螟的为害。
　　水稻自身生化物质的变化会影响其对靶标害虫的抗性，利用氯虫苯甲酰胺拌种处理水稻种子，可刺激植株不同生育期的生化物质对其做出响应，从而影响害虫取食能力。利用氯虫苯甲酰胺处理水稻种子可有效控制田间稻纵卷叶螟的为害，一方面是因为植株体内的残留药剂可以直接控制稻纵卷叶螟，另一方面是因为水稻体内抗虫物质（类黄酮和草酸）含量增加，影响稻纵卷叶螟的取食及其生长发育，从而有效控制稻纵卷叶螟对水稻的为害和种群数量的增长。后续研究应结合氯虫苯甲酰胺拌种处理在水稻不同生育期对稻纵卷叶螟的防治效果，进一步探索水稻植株体内生化物质变化与控害能力之间的关系。
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