siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤细胞生物学特性影响

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　　[摘要]目的探讨小分子干扰RNA（siRNA）沉默Polo样激酶1（PLK1）基因对骨肉瘤细胞生物学特性的影响。方法培养人骨肉瘤MG`-63细胞，将其随机分为空白组、siRNA`-对照序列组和siRNA`-PLK1组。采用实时荧光定量PCR技术检测细胞中PLK1基因表达，Western blot法检测细胞中PLK1蛋白表达，CCK`-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。结果siRNA`-PLK1组细胞中PLK1 mRNA和蛋白相对表达量均低于空白组和siRNA`-对照序列组，差异有统计学意义（F=129.125、62.363，P<0.01）。与空白组和siRNA`-对照序列组相比，siRNA`-PLK1组细胞培养48、72和96 h时的增殖活性均降低，差异有统计学意义（F组间=32.021，F时间=357.249，F交互=5.755，P<0.01）。与空白组和siRNA`-对照序列组相比，siRNA`-PLK1组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（F=69.863，P<0.01）。siRNA`-PLK1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于空白组和siRNA`-对照序列组，差异有统计学意义（F=28.998、34.783，P<0.01）。结论特异性沉默骨肉瘤细胞中PLK1基因表达可减少细胞增殖、增加细胞凋亡，抑制细胞侵袭、迁移能力。
　　[关键词]骨肉瘤;Polo样激酶1;RNA，小分子干扰;细胞生物学
　　[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） silencing of polo`-like kinase 1 （PLK1） on the biological characteristics of osteosarcoma cells. MethodsHuman osteosarcoma MG`-63 cells were cultured and randomly divided into blank group， siRNA`-control sequence group， and siRNA`-PLK1 group. Quantitative real`-time PCR and Wes`-tern blot were used to measure the mRNA and protein expression of PLK1 in cells; CCK`-8 assay was used to measure cell proliferation acti`-vity; flow cytometry was used to measure cell apoptosis; the Transwell method was used to measure cell migration and invasion abilities. ResultsThe siRNA`-PLK1 group had significantly lower relative mRNA and protein expression of PLK1 in cells than the blank group and the siRNA`-control sequence group （F=129.125 and 62.363，P<0.01）. Compared with the blank group and the siRNA`-control sequence group， the siRNA`-PLK1 group had significant reductions in proliferation activity at 48， 72， and 96 h of culture （Fgroup=32.021，Ftime=357.249，Finteraction=5.755，P<0.01）. Compared with the blank group and the siRNA`-control sequence group， the siRNA`-PLK1 group had a significant increase in cell apoptosis rate （F=69.863，P<0.01）. The siRNA`-PLK1 group had significantly lower numbers of migrating cells and invasive cells than the control group and the siRNA`-control sequence group （F=28.998 and 34.783，P<0.01）. ConclusionSpecific silencing of PLK1 gene expression in osteosarcoma cells can reduce cell proliferation， increase cell apoptosis， and inhibit cell invasion and migration.
　　[KEY WORDS]osteosarcoma; Polo`-like kinase 1; RNA， small interfering; cell biology
　　骨肉瘤好發于青少年人群，恶性程度高，可早期发生转移，复发率较高，预后多不良[1]，严重威胁病人生存健康。近年来，虽然临床诊疗水平不断进步，但骨肉瘤病人复发率和5年生存率并未得到明显改善[2]。有研究指出，骨肉瘤细胞增殖、分化、侵袭、转移能力强是影响肿瘤预后的主要因素[3]。但目前影响骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移的机制尚未完全清楚。Polo样激酶1（PLK1）是PLK家族重要成员，是一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞分裂、DNA损伤修复中发挥重要作用[4]。有研究指出，PLK1在多种恶性肿瘤中呈高表达，参与了肿瘤发生、进展过程[5]。本研究利用小分子干扰RNA（siRNA）技术特异性沉默人骨肉瘤MG`-63细胞系中的PLK1基因，观察其对细胞生物学特性的影响，以期为骨肉瘤机制研究及临床诊治提供基础资料。现将结果报告如下。 　　1材料与方法
　　1.1主要材料
　　人骨肉瘤MG`-63细胞系购自美国ATCC公司，RPMI`-1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，Trizol总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术公司，Lipofectamine2000转染试剂购自北京方程佰金科技公司，逆转录和PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，PLK1及内参引物由上海生工生物公司设计合成，siRNA`-PLK1、siRNA`-对照序列由上海吉玛制药技术公司设计合成，Transwell小室购自美国Millipore公司，兔抗人PLK1多克隆抗体购自美国Calbiochem公司，Annexin V`-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司，凝胶电泳分析系统购自美国Bio`-rad公司。
　　1.2实验方法
　　1.2.1细胞培养及分组MG`-63细胞加含体积分数0.10胎牛血清的RPMI`-1640培养液，置于含体积分数0.05 CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到80%左右时传代。取对数生长期的细胞进行转染[6]，并将细胞分为以下3组。①空白组（A组）：不作任何处理;②siRNA`-对照序列组（B组）：转染对照序列5′`-AAUUUGGCCGGGCCGU`-GCG`-3′;③siRNA`-PLK1组（C组）：转染PLK1基因的siRNA序列5′`-AAGGGCGGCUUUGCCAA`-GUGC`-3′。各组转染完成后继续恒温培养24 h，完成后续实验。
　　1.2.2实时荧光定量PCR技术检测细胞中PLK1基因表达取各组转染后培养48 h的细胞，胰酶消化后，用裂解液裂解，按Trizol总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，并检测纯度和浓度，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板行PCR。PLK1及内参引物序列见表1。PCR反应条件为：95 ℃、3 min，95 ℃、40 s，58 ℃、40 s，70 ℃、40 s，循环36次。每个样本均设6个平行复孔。用2-△△Ct法计算各组细胞中PLK1 mRNA相对表达量[7]。
　　1.2.3Western blot法检测细胞中PLK1蛋白的表達取各组转染后培养48 h的细胞，胰酶消化后用裂解液裂解，提取细胞中总蛋白，用BCA总蛋白检测试剂盒检测蛋白纯度和浓度。取30 μg总蛋白，行SDS`-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜，室温下用含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭60 min，加入一抗兔抗人PLK1多克隆抗体（稀释比例1∶1 000），4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室温下孵育120 min，TBST洗膜3次，加入ECL避光反应25 min，拍照，应用Image J图像分析软件对灰度值进行定量分析，获得各组细胞中PLK1蛋白相对表达量[8]。
　　1.2.4CCK`-8法检测细胞增殖活性取各组转染后培养48 h的细胞，消化后接种于96孔板中，将细胞密度调整为每孔2×104个，置于含体积分数0.05 CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。分别于培养24、48、72和96 h时，将孔板中的培养液去除，加入100 μL的无血清培养液和10 μL的CCK`-8溶液，空白组仅加入无血清培养液，继续37 ℃恒温孵育120 min。用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度（A）值[9]。
　　1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡取各组转染后培养48 h的细胞，胰酶消化后收集细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，用1×缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×109/L，取100 μL细胞悬液加入流式管中，再分别加入5 μL的Annexin V`-FITC和PI，摇匀，室温下在暗室中孵育20 min，60 min内上机检测[10]。
　　1.2.6Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力迁移能力检测：取各组转染后培养48 h的细胞，消化，离心，用无血清培养液重悬细胞并计数，取2×104个细胞加入小室上室，将含体积分数0.20胎牛血清的RPMI`-1640培养液600 μL加入下室，培养24 h，甲醛固定，10 g/L结晶紫染色，将散落的细胞用棉签轻轻去除，以PBS冲洗3次，拍照，于高倍镜下随机取5个视野计数穿膜细胞数[11`-12]。侵袭能力检测：取50 μL的Matrigel胶平铺于Transwell小室内侧，风干后备用;其余步骤同迁移能力检测。
　　1.3统计学分析
　　使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD`-t检验，重复测量资料的比较采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2期范兆阳，等. siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤细胞生物学特性影响173
　　2结果
　　2.1PLK1在各组细胞中的表达
　　与空白组和siRNA`-对照序列组比较，siRNA`-PLK1组细胞中PLK1 mRNA和蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（F=129.125、62.363，P<0.01）。见表2和图1。
　　2.2各组细胞增殖活性比较
　　与空白组和siRNA`-对照序列组比较，siRNA`-PLK1组细胞培养48、72和96 h时的A值均降低，差异有统计学意义（F组间=32.021，F时间=357.249，F交互=5.755，P<0.01）。见表3。
　　2.3各组细胞凋亡率比较
　　siRNA`-PLK1组、siRNA`-对照序列组和空白组细胞凋亡率分别为（6.7±2.2）%、（6.5±0.9）%和（14.9±1.4）%，与空白组和siRNA`-对照序列组比较，siRNA`-PLK1组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（F=69.863，P<0.01）。 　　2.4各组细胞迁移和侵袭能力比较
　　siRNA`-PLK1组迁移细胞數和侵袭细胞数均低于空白组和siRNA`-对照序列组，差异有统计学意义（F=28.998、34.783，P<0.01）。见表4。
　　3讨论
　　骨肉瘤作为严重威胁青少年健康的常见恶性肿瘤，具有较强的侵袭、转移能力，约20%的病人在临床确诊时已出现肺转移，约50%的病人在治疗过程中发生肺转移[13`-15]。目前，骨肉瘤病人整体治疗效果仍不佳，多数病人预后不良，5年生存率尚不足30%[16]。细胞异常增殖和侵袭是骨肉瘤发生远处转移及治疗失败的主要原因[17`-18]。PLK1作为丝/苏氨酸激酶家族成员，在调控细胞周期、促进有丝分裂及胞质分裂中发挥关键性作用[19`-20]。研究表明，多数恶性肿瘤组织中PLK1呈高表达，且与病人预后有关[21`-23]。抑制或敲除PLK1基因可促进肿瘤细胞凋亡，增加其对化疗药物的敏感性，且不会对正常细胞产生影响[24]。有研究表明，PLK1抑制剂可抑制骨肉瘤细胞的增殖，且PLK1蛋白水平的高表达与病人不良预后密切相关[25]。
　　本研究利用siRNA技术特异性下调骨肉瘤细胞中PLK1表达，结果显示，siRNA`-PLK1组细胞中PLK1 mRNA和蛋白相对表达量均显著降低，表明PLK1基因表达被抑制。进一步的实验结果显示，siRNA`-PLK1组细胞培养48、72和96 h时的A值均较siRNA`-对照序列组和空白组明显降低，说明特异性抑制PLK1基因表达可有效抑制骨肉瘤细胞增殖，这与以往的有关研究结论相一致[26]。刘晓影等[27]通过建立食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤研究显示，下调PLK1表达可抑制移植瘤的生长。本研究结果显示，特异性抑制骨肉瘤细胞中PLK1基因表达后，骨肉瘤细胞凋亡率显著增加，说明抑制PLK1基因表达可促进骨肉瘤细胞凋亡。毛永欢等[28]的研究结果亦表明，靶向沉默PLK1基因可促进胰腺癌细胞凋亡。有研究表明，PLK1基因与细胞分裂关系密切，在肝癌等实体肿瘤细胞侵袭、迁移中发挥重要作用[29]。丁克云等[30]研究表明，干扰PLK1表达可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭，其机制可能与诱导失巢凋亡有关。本研究结果显示，siRNA`-PLK1组迁移细胞数和侵袭细胞数较siRNA`-对照序列组和空白组均减少，说明PLK1基因表达与骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力有关，提示PLK1基因可能参与了骨肉瘤细胞侵袭、迁移过程，并在此过程中发挥重要作用。
　　综上所述，沉默PLK1基因表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，并且可抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力，有望为骨肉瘤临床诊疗提供新的靶位。下一步我们将从分子生物学角度更加深入探讨PLK1在骨肉瘤发生及进展中的作用机制。
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