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TNIP1基因沉默对系统性红斑狼疮患者B细胞上BCR、CD40基因表达的影响

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  [摘要]目的 探讨TNIP1基因沉默对系统性红斑狼疮(SLE)患者B细胞上BCR和CD40基因表达的影响。方法 收集2018年3月武汉大学医院接收的20例SLE患者和20例健康体检者的血液标本,以慢病毒介导TNIP1基因沉默为切入点,采用实时荧光定量PCR方法检测细胞中的TNIP1基因中mRNA的表达水平以及BCR、CD40的表达水平。结果 TNIP1基因在SLE患者中的表达量较高,干扰B细胞中TNIP1基因可导致B细胞中BCR和CD40表达下调。结论 TNIP1、BCR和CD40基因在B细胞中的表达具有一致的表达趋势,提示TNIP1、BCR、CD40有一定的调控关系。
  [關键词]系统性红斑狼疮;B淋巴细胞;TNIP1;基因沉默
  [中图分类号] R758.62 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2019)5(c)-0018-05
  [Abstract] Objective To explore the effect of TNIP1 gene silence on the expression of BCR and CD40 gene in B cells of patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Blood samples from 20 SLE patients and 20 healthy subjects received in Wuhan University Hospital during March 2018 were collected. Lentiviral-mediated TNIP1 gene silence was used as an entry point. Real-time quantitative PCR was used to detect mRNA expression level as well as expression levels of BCR and CD40 in TNIP1 gene in cells. Results The expression level of TNIP1 gene was higher in SLE patients, and interference with TNIP1 gene in B cells could lead to down-regulation of BCR and CD40 expression in B cells. Conclusion The expression of TNIP1, BCR and CD40 genes in B cells show a consistent trend, suggesting that TNIP1, BCR and CD40 have a certain regulatory relationship.
  [Key words] Systemic lupus erythematosus; B lymphocytes; TNIP1 gene; Gene silence
  系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多发于青年女性的累及多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织疾病。在遗传因素、环境因素等各种因素相互作用下,导致T淋巴细胞减少、B淋巴细胞非正常增生、T抑制细胞功能降低,产生大量的抗体和自身抗原相互结合形成一种免疫复合物,引起机体的多系统损害[1]。具体表现有关节通、关节炎、皮肤病、胸腔积液、神经系统受累、心肌炎、肾病综合征等疾病,而其中45%以上的SLE患者临床上有肾脏病变[2]。本研究旨在探讨TNIP1(TNFAIP3-interacting protein1)基因沉默对SLE患者B细胞上BCR和CD40基因表达的影响,以期为SLE的发病机制提供依据,现报道如下。
  1资料与方法
  1.1一般资料
  选取武汉大学医院风湿免疫科门诊2018年3月收治的20例SLE患者和20例健康体检者(无SLE家族史;近期无感染病史)。排除标准:妊娠、哺乳期和月经期的妇女;凝血出血病史和出血倾向;心脏休克史,心室梗死,心肺复苏。本研究中所有个体参与者获得知情同意,所有人员均自愿加入本研究,血样的采集等相关操作符合武汉大学医学院的医学伦理审查。所有参与者在空腹情况下抽取静脉血10 ml供研究所用。
  1.2实验仪器与试剂
  实验仪器:低温高速离心机(Eppendorf,德国);磁力分选柱(Miltenyi Biottc公司LS Columns,德国);NanoDrop 2000分光光度计(Thermo公司,美国);PCR扩增仪(Eppendorf公司Mastercycle,德国);实时荧光定量PCR仪(ABI 7500 Sequence Detection System,美国)。
  实验试剂:人外周血淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(北京索来宝生物技术有限公司);CD19抗体的免疫分选磁珠(德国美天旎);RNA提取试剂盒(武汉塞维尔科技公司);质粒提取试剂盒(Omega公司);反转录试剂盒(上海生工生物有限公司);RT-PCR试剂盒(上海生工生物有限公司);琼脂糖、溴酚蓝、溴化乙锭(美国Sigma公司)。
  1.3实验方法
  1.3.1 293T细胞的培养 将培养基(10%血清、100 U/ml双抗青链霉素)和PBS放于37℃水浴锅中预热,将已长到80%~90%的293T细胞培养瓶从37℃、5%的CO2的恒温培养箱中取出,用无菌的移液管吸净其中的培养基,加5 ml的预热PBS洗涤1次,吸净PBS,准备转染质粒。
  1.3.2质粒提取 参照Omega公司的质粒提取试剂盒说明书进行操作。   1.3.3病毒包装 将293T细胞原先的培养基抽吸掉,然后转为6 ml的无双抗,无胎牛血清的纯DMEM培养基,再放入恒温培养箱中待用。将TNIP1-siRNA(设置为干扰组)、pLKO.1(设置为对照组)及包装质粒psPAX2、pMD2.G以3∶1的比例进行细胞转染。即取两只新的1.5 ml的EP管,分别加入2 μg TNIP1-siRNA、2 μg包装质粒(1500 ng psPAX2和500 ng pMD2.G)和2 μg pLKO.1和2 μg包装质粒,再分别加入200 μl纯DMEM培养基。取12 μl罗氏转染试剂于300 μl的纯培养基(10%血清、100 U/ml雙抗青链霉素)中,常温静置6 min。将转染的试剂稀释液加入DNA稀释液中,于室温静置20 min后,将混匀的物质加入到培养基中,6 h后补加10%胎牛血清(600 μl),1%双抗(60 μl)。分别收集48、72、96 h的细胞上清液,再用0.22 μm的过滤器过滤后放于-20℃备用。
  1.3.4外周血淋巴细胞的分离 向新鲜的血液中加入同等体积的PBS,颠倒混均。取10 ml离心管向里面分别加入提前预热至室温的与混合后相同体积的细胞分离液。室温、2000 r/min离心20 min。拿出一只新的10 ml离心管,用移液枪将吸出的淋巴细胞层转移进去,再加满PBS溶液,使PBS溶液与淋巴细胞充分混合均匀。将上述10 ml离心管进行离心,1500 r/min离心20 min。取出离心管,可现离心管底部有沉淀。用抽滤泵将上层液体抽滤掉只剩沉淀。
  1.3.5免疫磁珠标记和分选外周血CD19+ B淋巴细胞 在通过磁力架的外磁场中,CD19+ B淋巴细胞则被吸附在磁场中停留,而其他无该表面抗原的细胞不能与磁珠上的单抗特异性结合则不能停留在磁场中,达到分离的效果。
  1.3.6 B淋巴细胞感染 各取1 ml新鲜的1640培养基分别加入到上述只有CD19+ B淋巴细胞的15 ml离心管中,充分吹打混合均匀。将上述混合均匀的两管培养基转移到8孔培养板中,只选4个孔用,每个孔中加入500 μl上述混合后的培养基,即2个孔为健康体检者,2个孔为SLE患者。健康体检者和SLE患者的2孔中分别各加入500 μl TNIP1-siRNA、pLKO.1病毒液,再分别加入1 μl能增加病毒感染力的poly-brene(终浓度为6 μg/ml)。将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中培养中感染24 h。24 h后取出培养板,将每个孔中的混合液转移至15 ml离心管中,1600 r/min,离心10 min。取出离心管,去上清,每只离心管中加入500 μl新鲜的1640培养基,充分吹打混合均匀。将上述混合均匀的4只离心管中的培养基转移到新的8孔培养板中。
  1.3.7外周血淋巴细胞总RNA提取 参照omega公司的RNA提取试剂盒说明书进行操作。
  1.3.8反转录cDNA合成 参照试剂盒,按照说明书操作,合成cDNA。基因组DNA去除反应体系(表1)和反转录反应体系(表2)。体系配好后置于PCR扩增仪中设置程序为42℃,2 min;4℃,hold。体系配好后继续置于PCR扩增仪中设置程序为37℃,15 min;85℃,5 s;4℃,hold;-20°C保存。
  1.3.9 RT-PCR检测TNIP1基因在B淋巴细胞中的表达 合成TNIP1引物:根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)登录(登录号BC014008.1)得TNIP1基因序列(表3);应用Primer Permier 5.0软件和NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)上的序列比对功能设计qRT-PCR引物,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实时荧光定量PCR反应:根据RT-PCR试剂盒操作说明书配制,按表4成分配置每管20 μl的体系。反应程序为:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,58℃退火45 s,共35个循环,72℃加长延伸10 min。
  1.4统计学方法
  ΔΔCt法:A=CT(目的基因,待测样本)-CT(内标基因,待测样本)、B=CT(目的基因,对照样本)-CT(内标基因,对照样本)、K=A-B表达倍数=2-K。计算后再进行定量分析,其中用β-actin基因的转录水平进行校准。采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,计量资料两组间比较进行t检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异显著,P<0.001为差异极显著。
  2结果
  2.1 TNIP1、β-actin、BCR及CD40基因溶解曲线和扩增曲线
  首先检测TNIP1、β-actin、BCR和CD40的qRT-PCR引物质量,图1A(封四)显示,所设计引物溶解曲线波形陡直,四个引物无杂峰,提示用于实验的引物有效,质量较好,而且扩增产物单一,因此该引物可以用于检测TNIP1基因的表达情况。图1B(封四)显示,四个基因的扩增曲线,三个复孔的重复性好,提示实验操作中复孔之间的差异小,操作所引起的实验误差很小。
  2.2 qRT-PCR检测TNIP1 mRNA的表达水平
  qRT-PCR检测TNIP1沉默后mRNA的表达水平,结果显示,健康体检者和SLE患者干扰组(TNIP1-siRNA)的TNIP1 mRNA表达水平均显著低于对照组(pLKO.1)的TNIP1 mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)(图2A)。提示慢病毒介导的基因沉默的效率较高,成功地使TNIP1基因在B细胞中转录水平显著下调。同时通过分析健康体检者和SLE患者的TNIP1表达,结果显示,TNIP1在SLE患者中的表达量较高(图2B),提示TNIP1的表达异常升高可能是SLE发病的一个因素。   2.3 qRT-PCR检测BCR和CD40 mRNA的表达水平
  进一步分析了TNIP1基因沉默后B细胞活化标志分子BCR和CD40的mRNA的表达水平,结果显示,BCR的表达在健康体检者中下调表达差异不明显,但在SLE患者中表达差异明显(P<0.001)(图3A);无论是SLE患者还是健康体检者,随着TNIP1基因的下调,干扰组(TNIP1-siRNA)的CD40表达水平低于对照组(pLKO.1)的CD40表达水平,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(图3B)。提示BCR、CD40基因和TNIP1基因是同步下调的,干扰B细胞中TNIP1基因可导致B细胞中BCR和CD40表达下调,进一步提示TNIP1基因表达水平与BCR和CD40的表达存在某种相关性。
  3讨论
  目前,SLE确切病因不明,是各种因素综合作用的结果,目前认为该病是在遗传基础上,某些特定的因素如环境因素,药物、食物、细菌病毒感染等导致SLE的发生。其中,遗传因素是使SLE疾病发生的重要因素,研究表明,SLE发病具有家族聚集倾向[3]。但是各种环境因素,如环境污染在SLE的发病中起到促进作用。SLE是一种复杂的多基因性遗传病。通过全基因组关联研究及多项候选基因研究(genome-wide association study,GWAS)分析法分析诸多SLE患者后发现,患者体内的TNIP1基因表达异常等[4],在对SLE的发病机制研究中发现易感基因的出现帮助人类在基因组层面更加深刻了解到SLE疾病,报道并证实了TNIP1为我国汉族人群SLE发病新的易感基因,提示TNIP1基因在调控自身免疫性炎症形成方面具有重要作用[5]。迄今为止SLE尚无根治的方案,只能控制病情恶化,延长生命。SLE病多侵犯育龄期女性,其发病及患病率在性别、区域及种族上存在较大差异性[6]。
  TNIP1即肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3(TNFAIP3)的相互作用蛋白1,在1999年第1次被克隆出来[7],是一种新型的内源性炎症调控因子,参与免疫功能的调节[8]。人类TNIP1基因位于染色体5q32-q33.1,cDNA基因长度1911 bp,有18个外显子,外显子1为非编码外显子[9]。研究认为TNIP1基因rs7708392位点的突变与SLE的发生有很大关系[10],而另有研究认为TNIP1基因rs7708392位点突变与SLE发病无关[11]。综上,TNIP1基因rs7708392位点的突变与SLE发病的关系仍存在争议。进一步的研究发现,TNIP1基因与免疫系统的关系密切[12],分布于很多神经、肌肉、免疫系统等,特别是在免疫系统的胸腺、骨骼肌、血液中表达活跃,而在大脑中低表达[13]。TNIP1在过表达的条件下,可以抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素1等从而诱导NF-κB的活性来发挥抗炎和免疫调节功能[14]。
  BCR是B细胞抗原受体,具有抗原结合特异性,同一个体内,BCR的多样性很高,可以组成容量巨大的BCR库[14],同时可以帮助个体识别各种各式抗原、产生特异性抗体[15]。BCR可直接识别完整的、天然的蛋白质抗原、多糖或脂类抗原[16]。BCR与抗原作用时有信号转导的重要作用,转导细胞增殖信号可引起机体免疫应答,而转导细胞凋亡信号会引起免疫耐受。这两者的异常则可引起机体免疫应答缺陷或自身免疫[17]。
  CD40是B细胞的一种表面抗原,具有抗原结合特异性,分子量为48KD,CD40为Ⅰ型跨膜糖蛋白,其基因定位于20q11-2g13-2[18],属肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员[19]。在很多细胞中均有表达,如B细胞、上皮细胞和一些肿瘤细胞系[20]。CD40的信号传导途径在不同细胞的转导是不一样的,正向调节可导致细胞增殖或分化,负调节则可导致细胞抑制和凋亡,CD40的信号转导主要是通过调节非受体型酪氨酸蛋白激酶来达成。CD40是SLE疾病领域研究中重要的分子之一[21]。
  本研究采用病例对照分析的方法,运用实时荧光定量PCR的方法,把SLE患者的外周血淋巴细胞中TNIP1基因与健康体检者的表达情况进行比较,结果显示,SLE患者的表达情况与健康体检者相比是上调的,可能TNIP1基因的表达上调会减少炎症因子的释放,TNIP1基因在活化的B细胞中特异性高表达。SLE患者中的B淋巴细胞的数目较多,也有可能是B细胞数目的增多导致了TNIP1基因的上调,TNIP1上调具有自身保护性。
  干扰SLE患者及健康體检者B细胞中的TNIP1基因,可以导致健康体检者和SLE患者中的TNIP1 mRNA表达情况均明显下调,干扰成功。RNA干扰B细胞中TNIP1基因导致B细胞上的BCR和CD40表达同步下调。综上,TNIP1、BCR和CD40基因在B细胞中的表达具有一致的表达趋势,提示TNIP1、BCR、CD40有一定的调控关系,TNIP1基因可能通过调节受体后信号通路转导影响BCR和CD40介导的信号途径和BCR和CD40基因的表达,进而对B淋巴细胞在SLE免疫反应产生影响作用。TNIP1基因与SLE的发病机制有明显的相关性。
  BCR和CD40均是B淋巴细胞的抗原受体,具有特异性结合,与SLE的发病机制和机理有关。采用病毒介导TNIP1基因的方式导入B淋巴细胞中,有效沉默B细胞TNIP1基因,观察对B细胞中的BCR和CD40 mRNA表达情况的影响。结果显示,BCR、CD40的表达和TNIP1同步下调,提示TNIP基因的表达情况会影响BCR和CD40基因的表达,TNIP1具有调节信号通路转导的功能,可能通过某种分子信号转导途径这种方式,或者TNIP1调控B细胞活性,而BCR、CD40与B细胞活性相关,但具体的影响机制并不清楚。维持B细胞内环境的相对稳定性需要如BCR、CD40等多种细胞表面受体的整合。TNIP1基因的表达会影响BCR和CD40的表达,使患者的炎症减轻,改善免疫反应,维持机体免疫稳态等。   综上所述,TNIP1、BCR和CD40基因在B细胞中的表达具有一致的表达趋势,提示TNIP1、BCR、CD40有一定的调控关系。
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  (收稿日期:2018-10-29 本文编辑:任秀兰)
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