环介导等温扩增技术检测小苍兰花叶病毒

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　　摘要小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus（FreMV）是侵染兰花的主要病毒，严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物，经过一系列条件优化，建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV，与其他4种病毒（菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumbermosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus）不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中，RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致，检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenI直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV，可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。
　　关键词小苍兰花叶病毒;RT-LAMP;检测
　　中图分类号：S436.8文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018164
　　小苍兰Freesia hybrida为鸢尾科香雪兰属花卉，因其花色艳丽、高雅芳香、花序柔美摇曳，深受消费者喜爱。小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus（FreMV）是危害小苍兰最严重、最常见的病毒之一，造成花色杂，植物生长不良，观赏价值降低，甚至造成种球退化，失去再利用的价值，已经成为小苍兰大规模生产的主要限制因素。目前，小苍兰病毒尚无特别有效的化学防治方法，培育和栽培无病毒苗成为防治小苍兰病毒的根本措施，在无毒苗培育过程中，经常需要对母本及脱毒苗进行病毒检测，建立快速、灵敏的检测技术显得尤为重要。
　　目前，病毒检测主要有酶联免疫法和PCR检测法等方法。酶联免疫法是目前较常用的一种方法，但其存在灵敏度不高、假阳性等缺点。近几年，灵敏度较高的PCR技术已成为常规的病毒检测手段，但其对实验设备要求比较高，不利于向基层检验部门推广。环介导等温核酸扩增技术（100p-mediated isothermal amplification，LAMP）采用6区域4条特异引物，在DNA链置换聚合酶（BstDNA polymerase）作用下，对靶基因进行恒温扩增，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速、检测结果肉眼可判等特點，摆脱了对昂贵仪器的依赖，能满足基层的检测需要。本研究以FreMV的外壳蛋白（CP）基因为靶标基因，设计4条引物，建立了可特异检测该病毒的RT-LAMP检测方法。
　　3讨论
　　小苍兰由于香气浓郁，花色种类丰富，颜色鲜艳，备受人们喜爱，是重要的切花及盆花。但当病毒病积累时会造成种球退化，限制小苍兰大规模生产。对种球进行复壮及培育无病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、准确、高效的检测方法，及时检测出带毒种球或脱毒苗，对阻止病毒病的传播，从根源上预防病毒病具有重要意义。本试验针对小苍兰花叶病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速、高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，可以针对性地对小苍兰复壮种球和脱毒种苗进行检测，从种源遏制病毒病的发生。本研究技术具有较高的应用价值，在基层和现场检测中有很好的应用前景。
　　目前，常用的病毒检测方法是PCR和酶联免疫技术，这些方法均具有较好的检测效果，但也存在耗时长，成本高的特点，不太适用于基层检测。与常规PCR方法相比，本研究建立的LAMP技术保持了PCR技术优点，且不需特殊仪器，成本低，由于不需要热循环，整个过程可以在60min内完成，更加省时。若在PCR产物中加入SYBR Green工可目测检测结果，检测更快捷方便，适合在基层应用。
　　LAMP技术使用4～6条引物，会进一步增强反应的特异性。引物设计至关重要，也较复杂和困难，除要遵循一般引物设计原则外，还有LAMP引物设计自身要注意的事项。对于GC含量较高序列或较短序列其引物设计更加困难。本试验针对小苍兰花叶病毒CP基因设计引物，经验证该引物的特异性良好。同时，本试验建立的LAMP方法检测FreMV具有较高的灵敏度，是RT-PCR的10倍，在病毒含量很少的脱毒苗的快速检测方面有一定的优势。
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