染色质免疫沉淀技术及其应用
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作者:王远锏
摘 要：染色质免疫沉淀技术是一种利用抗原抗体结合的特异性来检测蛋白质与基因互作的技术，具有高效率但是低重复性的特点，影响实验结果分辨率的因素包括检测样品使用量、DNA片段断裂程度、抗体亲和性等。随着该技术的不断发展，其应用范围也逐渐扩大到如DNA测序、蛋白质修饰、对细胞类型特异性串联染色质表观遗传修饰研究等方面，并逐步与如高通量测序技术、免疫荧光技术等其他研究手段相结合，在蛋白质尤其是组蛋白及其修饰产物与DNA互作研究领域发挥作用。
关键词：染色质免疫技术 蛋白质基因互作
中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2019）07（a）-0120-02
目前研究蛋白质与DNA互作的手段较多，其中染色质免疫沉淀技术是一种可以在体内活性环境下测定基因与蛋白互作的手段，自该技术创建以来，从单个蛋白与DNA互作、数个蛋白与DNA互作进而发展到目的蛋白与未知序列互作的研究，进一步延伸出检测组蛋白修饰与DNA片段测序应用，再与免疫荧光技术、高通量测序技术、基因芯片技术等相结合，在其他研究领域也有着广泛应用。
1 染色质免疫沉淀技术原理
染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecitation， ChIP）是一种利用抗原抗体特异性结合反应在生理状态下测定蛋白质与DNA互作的技术。首先将研究的细胞进行固定化，常用的固定化手段是使用福尔马林固定，再使细胞维持在一个自然稳定的状态，同时甲醛还可以将将DNA与蛋白质进行交联，以便于进一步操作。之后将DNA打断成为200～1000bp的片段，可以使用超声波处理随机将DNA打破，也可以使用核酸酶特异性酶切长链。使用特异性抗体将与蛋白质相互结合的DNA片段进行沉淀，得到的沉淀进行进一步纯化。之后使用如蛋白酶K[1]等手段将沉淀进行解交联并使用层析等纯化DNA片段，以便于进一步对目标DNA进行扩增与分析。之后使用PCR等对得到的DNA片段构建其相应的测序文库，最后使用高通量测序技术对DNA进行测序，分析与蛋白的结合位点。最后对蛋白与DNA的结合位点进行验证。
2 影响ChIP检测结果的因素
ChIP可重复性较低，干扰因素较多，主要是影响DNA片段、蛋白质交联体与相应抗体的结合程度，包括检测样品使用量、DNA片段断裂程度、抗体亲和性等方面。样品使用量直接影响的是DNA与蛋白交联体破碎程度与抗体结合底物量，当样品使用量过大时，对DNA的破碎程度不够，在进一步的抗原抗体结合沉淀与DNA测序等过程均有较大影响。DNA片段的断裂程度主要由处理手段决定，常见的如超声波处理断裂DNA片段中，超声波破碎仪器的型号、超声波的频率等就是常见的影响ChIP检测结果的因素。不同的超声波破碎仪的工作原理、工作最佳条件不同，将影响底物破碎程度，张媛媛[2]等人的研究对三种不同型号的超声波破碎仪 Bandelin Sonopuls HD 2070，Covaris M220 Focused-ultrasonicator、Bioruptor Plus.其中 Bandelin sonopuls HD 2070 为探头式超声破碎仪，而其他两种破碎仪器为非接触式超声破碎仪，且后者的破碎效果更好，CHIP检测结果分辨率更高。超声波的频率、处理时间与次数对ChIP实验结果也有明显影响，房艳华[3]等人对斜卧青霉转录调控因子Hac1进行实验，在最佳菌丝用量为1g菌丝/10mL ChIP缓冲液下，25W超声功率，工作时间5s，间隔时间40s，超声30次可以得到最佳分辨率的分析结果。抗体亲和性也是影响结果的重要因素之一，一般ChIP实验需要使用标准试剂盒或者已经经试验证明有效的抗体，对于未检测过的抗体最好使用IP/IHC/ICC进行检测[4]。另外，部分抗体受染色质溶液中的抑制因子影响较大，因此需要对抗体的用量和染色质溶液比例进行调整。
3 染色质免疫沉淀技术的应用
ChIP及其衍生技术目前在蛋白质-DNA互作、DNA测序、蛋白质尤其是组蛋白的修饰研究、细胞类型特异性串联染色质表观遗传修饰研究等方面均有广泛应用。在蛋白质-DNA互作方面，孙瑞[5]等人通过染色质免疫共沉淀确定了对核盘菌中Forkhead家族转录因子成员SsFox-E2可以参与调控核盘菌的有性生殖，进而对子囊盘的发育产生影响。组蛋白与DNA直接组装成核小体并影响着基因表达，组蛋白修饰基团的变化将直接影响其与DNA的结合情况并影响基因表达及表达产物量的大小，王文静[6]等利用ChIP确定组蛋白结合的DNA片段序列，PCR扩增并经过电泳检测确定组蛋白H3K9m2和H3K4m3是可能引起miR-338-3p下调的，进而引起如食道癌等疾病的发生。在检测复杂组织中特异性细胞表觀遗传修饰领域ChIP也发挥着重要作用，Mari Mito等人针对高等真核生物神经系统设计出了一种串联染色质免疫沉淀测序（tchip-Seq），这种手段通过使一种染色质组分FLAG-标记组蛋白h2b在Camk2a阳性锥体细胞中表达，并以细胞类型特异性的方式纯化染色质。针对一种主要与活性启动子相关的染色质修饰H3K4me3使用抗体的染色质免疫沉淀，从而观察Camk2a阳性锥体细胞中组蛋白修饰情况。通过这种手段在与神经元功能相关与关系未知的基因上游发现了数百个H3K4me3，以此证明这种串联染色质免疫沉淀测序可以做为一种研究体内特定细胞类型表观遗传修饰的通用方法。
参考文献
[1] 吴彤， 王瑞明， 黄磊，等. 蛋白酶K的研究进展[J]. 食品工业科技， 2013， 34（14）：380-384.
[2] 张媛媛，黄冬梅，邓班，等.植物叶片染色质免疫共沉淀方法的优化[J].福建农林大学学报（自然科学版），2018，47（3）：329-335.
[3] 房艳华， 韦小敏， 李肖，等. 斜卧青霉转录调控蛋白Hac1染色质免疫共沉淀分析方法的建立[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版， 2018（3）.
[4] NISHIKORI S，HATTORI T，FUCHS S M，et al. Broad ranges of affinity and specificity of anti-histone antibodies revealed by a quantitative peptide immunoprecipitation assay[J].Journal of Molecular Biology，2012，424（ 5） ： 391-399.
[5] Mito M ， Kadota M ， Tanaka K ， et al. Cell Type-Specific Survey of Epigenetic Modifications by Tandem Chromatin Immunoprecipitation Sequencing[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）：1143.
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