水稻清蛋白电泳鉴定方法及应用

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　　摘要 对清蛋白提取方法进行优化，建立水稻清蛋白电泳新方法。采用优化后清蛋白电泳方法进行谱带分析，发现蛋白含量相近、食味评分不同的水稻品种，70～105 kDa处谱带缺失或谱带浓度加强。初步确认105 kDa是与稻米食味相关的谱带，谱带颜色越深，稻米食味品质越好。
　　关键词 水稻;清蛋白;电泳;食味品质
　　中图分类号 S 511文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）01-0176-02
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.053
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Method and Application of Rice Albumin Electrophoresis Identification
　　LAN Jing1，2，JIA Wen jing1，2，SUN Xiang dong1，2 et al
　　（1.Quality and Safety Institute of Agricultural Products， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro products （Harbin）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin， Heilongjiang 150086）
　　Abstract The aim is to optimize the extraction method of albumin and establish a new method of rice albumin electrophoresis. It was found that forrice from different sources， a loss or enhancement of band indensity at 70-105 kDa with similar protein content whereas different sensory evaluation scores by using the improved spectral band analysis of albumin electrophoresis method. It was preliminarily confirmed that 105 kDa is the band associated with rice sensory quality. The denser the band， the better the taste quality of rice.
　　Key words Rice;Albumin;Electrophoresis;Taste quality
　　水稻品種的品质性状是育种工作的重要目标，早期品质选择方法的实用性与合理性是育种者关心的重要问题。水稻食味品质是水稻品质育种的终极目标[1-2]，在水稻早期世代材料筛选上一直是盲区，没有较好的评价技术。蛋白质作为稻米品质的主要性状，是稻米品质改良不可忽视的重要方面。关于蛋白质与稻米品质之间的关系，国内外已有的报道主要集中在表观蛋白质含量与食味品质之间的关系变化上[3]。通常稻米蛋白质含量越高其食味值越低[4-5]，而对于蛋白质含量接近的稻米其食味值有的相差较大，需从蛋白质组分、结构方面加以阐述。
　　水稻蛋白质中的贮藏蛋白质是水稻的第二大营养成分，含量占5.5%～12.0%。稻米中的蛋白质根据其在不同溶剂中的溶解性不同可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6]。贮藏蛋白在稻米中分布不均，清蛋白主要分布在糊粉层和次糊粉层。研究表明，清蛋白占水稻总贮藏蛋白的2%～5%[7-9]，是与食味品质相关的蛋白。目前有关清蛋白的研究报道甚少[10]，而关于清蛋白电泳技术鲜见报道。将水稻食味品质蛋白质电泳评价技术用于水稻早期世代材料筛选，对于缩短育种年限、加快水稻育种进程、提高水稻育种效率具有重要意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 水稻品种来源。
　　粗蛋白质含量接近、食味评分不同的水稻品种龙粳香1号、长粒香2号、垦粳12、龙粳29、五优稻、高粱稻来源见表1，其中长粒香2号分别来源于同江市和富锦市。不同来源水稻品种粗蛋白质含量7.76%～7.91%，食味评分71.0～90.0。
　　1.1.2 化学试剂。
　　所有试剂都是国产或进口分析纯，用蒸馏水配制有关溶液，电泳仪和电泳槽型号为BIO-RAD Power Pac，产地新加坡。
　　1.2 方法
　　1.2.1 大米粉制备和清蛋白提取。
　　稻米经自然风干后，每个稻米样品称取100 g，先用糙米机碾成糙米，再将糙米通过精米机碾成精米。精米经磨粉机碾磨成粉，-20 ℃冰箱保存备用。
　　清蛋白提取参考杨静等[5]、马建等[10]方法并进行优化。提取清蛋白的溶剂为蒸馏水，大米粉与蒸馏水的固液比为1∶1（g∶mL），摇床振荡提取2 h，15 000 r/min，离心5 min，取上清于2 mL离心管内，-20 ℃保存备用。
　　1.2.2 凝胶配制。
　　1.2.2.1 分离胶的配制。 　　（1）取27.23 g Trizma base 溶解于80 mL蒸馏水中，盐酸调pH至8.8，蒸馏水定容至150 mL。
　　（2）量取步骤（1）中的溶液25 mL，加入40 mL 30% MonomerSol’n，1 mL 10%SDS，33.5 mL蒸馏水，混匀4 ℃保存备用。
　　（3）量取步骤（2）中的溶液9.95 mL，加入50 μL 10% 过硫酸铵，5 μL TEMED，混匀，灌入胶板中，上层加入蒸馏水封口，等待分离胶凝固。
　　1.2.2.2 浓缩胶的配制。
　　（1）将6.0 gTrizma base 溶解于60 mL蒸馏水中，盐酸调pH至6.8，蒸馏水定容至100 mL。
　　（2）量取步骤（1）中的溶液25 mL，加入13 mL 30% MonomerSol’n，0.5 mL 10%SDS，61 mL蒸馏水，混匀4 ℃保存备用。
　　（3）量取步骤（2）中的溶液10 mL，加入50 μL 10% 过硫酸铵，10 μL TEMED，混匀，待分离胶凝固，倒出表面的水层，将配制好的浓缩胶灌入胶板中，然后插入梳子，等待凝固。
　　1.2.3 电泳。
　　蛋白提取液的配制：0.125 mol/LTris-HCl，pH=6.8，4%SDS，20%甘油，4 mol/L尿素，5% 巯基乙醇。
　　清蛋白进样量10 μL。电泳开始时，恒定电压为100 V，当样品到达分离胶时，降低电压恒定至80 V，电泳2.5 h。
　　1.2.4 蛋白固定。
　　电泳结束，取出凝胶，将凝胶浸入40 mL 10%三氯乙酸中，摇床振荡固定蛋白，过夜固定。
　　1.2.5 染色与脱色。
　　凝胶置于40 mL考马斯亮蓝R-250溶液中，摇床染色2 h，然后在冰乙酸∶甲醇∶水（10∶45∶45）溶液中脱色。
　　2 结果与分析
　　2.1 水稻清蛋白电泳方法优化
　　2.1.1 方法一。
　　称取0.1 g精米粉于2 mL离心管内，加入1 mL蒸馏水，于摇床上振荡提取2 h，室温下10 000 r/min离心10 min。将上清液转移到10 mL刻度试管中，重复提取3次合并提取液，即为清蛋白溶液，-20 ℃保存备用[5]。
　　2.1.2 方法二（改进方法）。
　　称取1 g精米粉于2 mL离心管内，加入1 mL蒸馏水，搅拌至均匀，浸提1 h，室温下15 000 r/min离心5 min。取上清液（清蛋白溶液）于2 mL离心管内，-20 ℃保存备用。
　　2.1.3 2种方法比较。
　　改进的水稻清蛋白提取方法，稻米经自然风干后研磨成大米粉，向大米粉中按固液比1∶1加入水，搅拌至均匀，浸提1 h后离心，取上清，即为水稻清蛋白提取液。浸提后室温下15 000 r/min离心5 min，较方法一离心力大，清蛋白提取效果更彻底。
　　由图1可知，方法一得到的清蛋白电泳图谱几乎看不见谱带（A）;而方法二得到的清蛋白图谱中谱带清晰可见（B），且方法二在2个水稻品种中的提取效果基本相同，说明该方法具有广泛适用性，稳定性好。
　　2.2 蛋白质含量相近的大米样品清蛋白电泳差异分析
　　对蛋白质含量接近、食味评分相差较大的7个样品进行清蛋白电泳图谱分析。从图2可以看出，龙粳香1号水稻样品谱带与其他样品谱带不同，在70～105 kDa处出现了谱带的缺失;在105 kDa处，长粒香2号样品也出现了谱带的缺失。由表1可知，这2个样品的食味评分很低。谱带颜色较深的高粱稻，其食味评分最高。龙粳29和五优稻的谱带颜色次之，其食味评分也对应下降。
　　3 讨论
　　目前对水稻清蛋白电泳方法研究较少，利用该方法对水稻食味品质进行评价鲜见报道。采用该研究提供的水稻清蛋白提取方法，提取的清蛋白更加充分，清蛋白提取率提高，且得到的电泳图谱更加清晰，适合于不同来源的水稻品种的鉴定，对指导水稻品质育种具有重要意义。
　　现有研究表明，水稻表观蛋白质含量越低，米饭食味值越高。对于表观蛋白质含量相近、食味值差异较大的水稻品种，通过清蛋白电泳图谱分析，初步发现105 kDa处谱带缺失，米饭食味值较低;105 kDa处谱带颜色越深，其米饭食味值越高。105 kDa为水稻食味优质亚基。该研究首次将水稻清蛋白电泳技术应用于稻米食味品质评价中，从蛋白质组分结构方面对稻米食味品质进行评价更加科学。
　　参考文献
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