柑桔溃疡病生物防治研究进展

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　　摘要：柑桔溃疡病是由地毯黄单胞杆菌（Xanthomonas axonopodis pv.Cirri.Xac）引起的危害全球柑桔的重要病害。生物防治以其高效、安全、环保受到柑桔溃疡病防控研究工作者们的青睐。从基因工程技术、生物拮抗菌及噬菌体技术等方面综述了柑桔溃疡病生物防治的研究进展。
　　关键词：柑桔溃疡病;病原菌;基因工程;拮杭菌;噬菌体
　　柑桔溃疡病（Citrus Bacterial Canker Disease，CBCD）是由地毯黄单胞杆菌（Xanthomonas axonopodispv.Citri.Xac）引起的危害全球柑桔的重要病害，是国内外检疫的对象[1]。该病害对柑桔造成极大的破坏，感染的严重程度会因不同的物种和品种以及气候条件而异。潮湿天气，细菌细胞从现有病变中渗出，为病害的进一步发展提供接种物。与许多其他细菌性疾病一样，病原菌借风雨、昆虫，从气孔、皮孔和伤口侵入。潜育期的长短因品种的抗（感）病性、组织的老熟程度和温度而异，一般為3～10d。在气温25～30℃下，雨量与病害发生成正相关，高温多雨季节发病严重[2]。柑桔溃疡病虽对人体无害，但会影响新鲜水果的适销性，造成经济损失。生物防治以其高效、安全、环保受到研究工作者们的青睐，利用生物技术防治溃疡病具有很大的潜力和市场前景。现将近年来柑桔溃疡病生物防治方面的研究进展作简要综述。
　　1 柑桔溃疡病的病原
　　柑桔溃疡病菌系具有品种特异性。由X.ax-onopodis pv.Citri（Xac）引起的柑桔溃疡病，是迄今为止最普遍和最严重的疾病。因最初出现在亚洲，所以称由该菌株导致的溃疡病为亚洲溃疡病（Asiatic citruscanker，ACC），即A菌系。该病在印度、巴基斯坦、印度洋岛屿、东南亚、中国和日本流行。B菌系，由X.ax-onopodis pv.aurantifolii引起的B菌系溃疡病（或假溃疡病）是巴拉圭、阿根廷、乌拉圭柠檬上的严重病害，墨西哥莱檬、酸橙和袖子也易受到影响。C菌系，也是由X.axonopodis pv.aurantifolii引起的，已在巴西的墨西哥酸橙中分离出来，症状与A菌系溃疡病相似[3-4]。1981年，在墨西哥的科马利地区莱檬上发现了1株单一菌株，主要为害墨西哥莱檬和袖子树以及波斯莱檬，即D菌系[5]。佛罗里达州于1984年发现了1株新的黄单胞菌株，该细菌与现有的引起溃疡病的A、B和C的2株X.axonopodis病原体无关，命名为X.axonopodis pv.cit-rumelo，即E菌系。在沙特阿曼、阿拉伯、伊朗、印度发现一种A*菌系，其宿主范围仅限于墨西哥莱檬，且与常见的A菌系有所不同[6]。在留尼旺岛和印度洋周围的岛屿发现了一种A菌株的非典型形式，其对青霉素相关抗生素具有高水平的抗性[7]。
　　2 生物防治
　　由于大量地施用化学药剂，造成植物体内农药残留累积、产量降低、环境污染，当前人们对蔬菜瓜果的无污染、无残留、无公害生产的需求越来越高，国内外柑桔产区都在积极探索生物防治策略以控制柑桔溃疡病，利用生物农药防治柑桔溃疡病已经成为人们关注的焦点。目前，柑桔溃疡病的生物防治仍处于基础研究阶段，主要是通过基因工程技术、生物拮抗菌及噬菌体技术等来抑制柑桔溃疡病的发生及感染。
　　2.1 基因工程技术
　　采用基因工程技术，可通过编码抗菌肽基因的过量表达、抗病蛋白和来自非植物来源的转录因子等策略，增强柑桔防御或在感染部位参与诱导程序性细胞死亡以提高柑桔对溃疡病的抵抗力。罗赛男等[8]将获得转TERF1基因糖橙的春梢叶片进行柑桔溃疡病病原菌的接种。试验表明，在接种病原菌后，转基因植株的平均发病率下降了50%左右，且发病的时间比冰糖橙和对照推迟了7d，其中3号株系的抗病性最强，叶片无病症。Yang等[9]通过农杆菌介导将pth A-nls转移到甜橙中。体外试验显示，当用2.5×107cfu/mL的溃疡病病原菌溶液进行针刺接种时，nls+转基因克隆没有显示典型的病变发展，体内试验结果表明，当针刺接种以104～105cfu/mL进行时，Sucarri甜橙的最低发病率为23.3%，Bingtang甜橙的发病率最低为33.3%。当喷雾接种104～107cfu/mL病原体时，nls+转基因克隆没有出现任何症状，甚至浓度升至109cfu/mL，发病率为20%～80%。
　　X Zhang等[10]生成表达拟南芥NPR1基因（At-NPR1）的转基因Duncan葡萄袖（DG）和Hamlin甜橙（Ham）。柑桔中AtNPR1的过量表达增加了对柑桔溃疡病的抗性，具有最高表达水平的AtNPR1的品系（DG 42-2）是最具抗性的，伴随着黄单胞菌属群体减少10倍，其产生明显较少的病变。Nicolas等[11]将菠萝甜橙植物用遗传构建体转化，促使蛙皮抗菌肽的组成型积累;与未转化的植物相比，转基因植物在受控条件下进行的植物测定中显示出减少了高达50%的柑桔溃疡病症状。此外，转基因植物中存在的较小尺寸的溃疡和在症状发展中观察到的延迟表明疾病严重程度显著降低。
　　Li等[12]通过农杆菌介导的胚性愈伤组织转化，将水稻基因Xa21与GUS报告基因和潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）一起导入安柳城甜橙。通过体外针刺接种评估3种回收的转基因系T2、T4和T6对柑桔溃疡病的耐受性，发现3种转基因株系均对柑桔溃疡病菌感染具有较高的抗性，T4转基因株系表现出较高的抗性。表明水稻Xa21基因为对抗柑桔溃疡病是可行的。
　　Sendin等[13]在柑桔转基因植株中评价了辣椒Bs2基因稳定表达对柑桔溃疡病抗性的影响。在表达Bs2的转基因品系中观察到相对于未转化的对照植物，溃疡病症状减少高达70%。Takehiko等[14]产生过量表达芳樟醇合成酶基因（CuSTS3-1）的转基因Hamlin甜橙（Citrus sinensis L.Osheck）植物，具有最高芳樟醇含量的转基因品系（LIL），在喷洒细菌时显示出对柑桔溃疡病的强抗性。 　　Adilson等[15]使用成熟外植体的薄切片的农杆菌介导的转化获得组成型表达与来自烟草的PR1a信号肽融合的肌肉毒素IA肽的转基因Pera甜橙，通过渗入和喷雾接种黄单胞菌进行转基因和非转基因植物叶片中的柑桔溃疡病抗性评估。与非转基因植物相比，转基因植物叶片中的黄单胞菌群体低至2个对数单位。在注射浸润或用黄单胞菌接种物喷雾后，非转化对照（大于10个病灶/cm2）中溃疡病灶的发生率显着高于转基因植物（小于5个病灶/cm2）。
　　2.2 生防拮杭菌
　　已知对柑桔溃疡病菌有拮抗作用的微生物有枯草芽孢杆菌（Bacillus suhtilis（Ehrenherg）Cohn 1872，174）、草生欧氏杆菌（Erwinia herhicola（Lohnis）Dye 1964，268）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula1895，29）和丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae vanHall 1902，141）以及腐生的Xanthomonas sp.[3]。
　　谭小艳等[16]从南宁柑桔园土壤中分离到1株对柑桔溃疡病菌具有强抑制力的鲍氏不动杆菌Bt8。在温室条件下将该细菌悬浮液喷施到柑桔叶片上，该菌对柑桔溃疡病具有53%的抑制率。
　　张洪波等[17]从柑桔叶表筛选出菌株KxI5和Kx48（初步鉴定分别属于葡萄糖杆菌属和乳酸杆菌属）对柑桔溃疡病防治效果明显，在温室条件下对柑桔溃疡病的防治效果分别达到45.6%和55.6%，在重病果园中的防治效果分别为40.3%、47.7%，且Kx48要优于KxI5。董玉兰等[18]从湖南省不同地区的土壤样品中筛选获得3株拮抗效果突出的菌株CLT3、CLH2、CZRI，且防效基本都在50%以上。其中以CLT3的防效最佳，达到83.85%。经鉴定CLT3为链霉菌属，CLH2为假甲胞蔚属，CZRI为克氏菌属。
　　马冠华等[19]筛选出3个对柑桔溃疡病菌有拮抗作用的放线菌菌株，抑菌圈直径达42.0～60.0mm，且能破坏柑桔溃疡病菌细胞膜完整性，增加细胞膜通透性，引起细胞质外渗。刘冰等[20]从赣南脐橙筛选到1株柑桔溃疡病生防内生细菌GN232，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis sub sp.Subtilis），其抗细菌活性代谢产物在中性环境下稳定，对温度不敏感，紫外线照射25min后发酵滤液抑菌活性降低，胰蛋白酶对发酵滤液活性无明显影响;此外，该菌株发酵上清液和农用链霉素混用后对溃疡病菌的抑制效果较单独发酵滤液、农用链霉素的抑菌效果分别提高26.8%和20.7%。
　　Julia等[21]从巴西Caatinga生物群系中分离的放线菌及其粗提取物针对不同的黄单胞菌属（Xan-thomonas citri）亚种菌株进行了测试。研究发现，Caat1-54提取物可有效预防Xcc对叶片的新感染，但不能减少预先建立的柑桔溃疡病灶中的Xcc群体。OrawanDaungfu等[22]从6种健康柑桔属植物中分离获得内生细菌。用解淀粉芽孢杆菌LE109或枯草芽孢杆菌LE24的细胞悬浮液接种的叶子可以完全控制柑桔溃疡病。而接种了B.tequilensis PO80的葉子显示出10%的发病率。用解淀粉芽孢杆菌LE109或枯草芽孢杆菌LE24的粗生物活性化合物处理的叶子可以完全控制柑桔溃疡病。但用B.tequilensis PO80的粗生物活性化合物处理的叶子显示出5%的发病率。
　　2.3 噬菌体技术
　　用于疾病控制的噬菌体的使用是植物保护的快速扩展领域，具有替代现有化学控制措施的巨大潜力。Balogh等[23]在温室实验中发现，噬菌体处理柑桔溃疡病，导致疾病严重程度平均降低59%。在商业柑桔苗圃试验中，噬菌体处理显著减少了中度敏感的瓦伦西亚橙溃疡病感染（48%和35%）;然而，在高度敏感的葡萄袖宿主上，它是无效的。在实验性柑桔苗圃中，噬菌体处理提供了由噬菌体敏感菌株引起的柑桔细菌斑的显著控制。
　　Ahmad等[24]分离并表征丝状噬菌体XacF1可以感染柑桔溃疡病菌。XacF1噬菌体的感染引起细菌宿主细胞的几种生理变化，包括较低水平的细胞外多糖产生，运动性降低，生长速度较慢以及毒力显著降低。毒力的降低表明可能利用XacF1作为抗柑桔溃疡病的生物控制剂。
　　当用商业系统获得性抗性（Systemic acquired re-sistance，SAR）诱导剂和拮抗性细菌作为柑桔溃疡病综合管理方法的一部分时，噬菌体处理表现出良好的效果。Ibrahim等固特阿拉伯温室和田间条件下的柑桔溃疡病叶子上，将配制的噬菌体与脱脂乳和蔗糖或非配制的噬菌体与acibenzolar-S-methy]（ASM）的组合应用与铜杀菌剂应用以抑制柑桔溃疡病相比较。在温室条件下，用氢氧化铜或噬菌体与ASM组合处理的植物，ACC在叶片上的发生率分别从75.2%显着降低至12.8%或18.3%。与未处理的对照植物相比，在田间条件下配制的噬菌体与ASM组合作为土壤灌溉的应用显著降低了14.8%（试验1）和16.8%（试验2）的发病率。用噬菌体与ASM组合处理的Xcc接种的植物在温室和田间条件下显示出显著的ACC降低。
　　3 问题与展望
　　柑桔溃疡病严重感染会导致多种后果，包括叶片脱落、果实品质下降和过早落果，是威胁柑桔产业健康发展的严重病害。目前，生物防治试验研究方法虽然能在一定程度上减轻柑桔溃疡病。但是，许多的生物拮抗菌及噬菌体的试验研究都是在室内进行，可以人为控制某些环境因素，田间环境多变且有许多不定因素，对其防治效果还有待研究。抗性栽培品种的使用是最好的、长期的、最具成本效益和永久有效的管理柑桔溃疡病的方案，而基因工程可以补充经典的柑桔育种并增强易感商业品种的抗病性。已有大量的研究表明，通过转基因技术引入抗性基因至感病品种能降低溃疡病的发生。虽然目前可通过基因工程技术提升植株抗溃疡病能力，但仍未大面积田间推广栽培。由于突变新菌株的产生，需要更好地了解Xac菌株的致病特性及正确鉴定，这对于培育新的柑桔溃疡病抗性品种具有重要意义。（收稿：2019-07-01） 　　參考文献：
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　　作者簡介：钱佳琳（1995-），女，硕士研究生，主要研究方向：柑桔溃疡病生物防治。
　　通信作者：余水静（1976-），男，副教授，博士，主要研究方向：环境微生物。
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