大肠杆菌工程菌mglB基因的敲除及水稻秸秆水解液发酵L-丙氨酸

来源:用户上传      作者:王灿 潘海亮 梁泉喜 王永泽 王金华

　　摘要  [目的]通過mglB基因敲除进一步降低混合糖发酵时常存在的葡萄糖效应，提高水稻秸秆水解液发酵L-丙氨酸的效率。 [方法]以大肠杆菌ptsG基因缺陷菌株JH-B3为出发菌，利用RED同源重组技术敲除葡萄糖转运基因mglB，构建ptsG和mglB双缺陷菌株JH-B6，分别以60 g/L葡萄糖、30 g/L木糖和水稻秸秆水解液为碳源进行发酵，验证mglB基因缺失对菌株利用葡萄糖、木糖和混合糖能力的影响。[结果]以60 g/L葡萄糖发酵时，JH-B6利用葡萄糖速率较JH-B3下降了19.9%;以30 g/L木糖发酵时，JH-B6利用木糖速率较JH-B3增加了23.5%;以水稻秸秆水解液发酵时，JH-B3发酵周期和糖酸转化率分别为128 h和89.5%，JH-B6发酵周期为88 h，较JH-B3缩短了31.3%，糖酸转化率为93.9%，较JH-B3提高了4.9%。[结论] 双基因缺陷型菌株JH-B6在ptsG基因缺陷菌株JH-B3的基础上缺失mglB基因，进一步降低了葡萄糖效应，提高了水稻秸秆水解液发酵L-丙氨酸的效率。
　　关键词 水稻秸秆;mglB基因;葡萄糖效应;L-丙氨酸;发酵
　　中图分类号 S182文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）07-0113-05
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.033
　　The Knockout of mglB Gene of Escherichia coli Engineering Strain and Lalanine Fermentation with Rice Straw Hydrolysate
　　WANG Can1， PAN Hailiang1， LIANG Quanxi2 et al
　　（1. Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan，Hubei 430068;2. Huakang Mengzhiyuan Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600）
　　Abstract [Objective]The knockout of the mglB gene was preformed to reduce the glucose effect which often presents in the mixed sugar fermentation， which might improve the efficiency of Lalanine fermenting using the rice straw hydrolysate. [Method]Using the E. coli ptsG genedeficient strain JHB3 as the starting strain， the glucose transport gene mglB was knocked out by RED homologous recombination technology to construct ptsG and mglB doubledeficient strain JHB6， respectively， with 60 g/L glucose and 30 g/L xylose and rice straw hydrolysate was fermented as a carbon source respectively to verify the effect of the mglB gene deletion on the ability of the strain to utilize glucose， xylose and mixed sugar. [Result]When fermented with 60 g/L glucose， the glucose consumption of JHB6 decreased by 19.9% compared with JHB3.In the case of fermented with 30 g/L xylose， the xylose consumption of JHB6 increased by 23.5% compared with JHB3. When fermented with rice straw hydrolysate， the fermentation time and sugar conversion of JHB3 were 128 h and 89.5%， respectively. The fermentation time of JHB6 was 88 h， which was 31.3% shorter than JHB3， and the sugar conversion of JHB6 was 93.9%， an increase of 4.9% over JHB3. [Conclusion]The deletion of mglB gene on the basis of ptsG genedeficient strain JHB3 further reduced the glucose effect and improved the fermentation efficiency of Lalanine in rice straw hydrolysate. 　　Key words Rice straw;mglB gene;Glucose effect;Lalanine;Fermentation
　　基金项目 国家“十二五”支撑计划（2012BAD27B03）。
　　作者简介 王灿（1991—），男，河南驻马店人，硕士，从事微生物工业发酵研究。通信作者，教授，从事有机酸工业发酵研究。
　　收稿日期 2019-09-23
　　我国是农业大国，每年都有大量的水稻秸秆产出。相关数据统计显示，2018年我国仅可收集的秸秆资源量高达约7亿t，其中水稻秸秆约2.1亿t[1]。作为可再生的优质生物能源，过去少数秸秆用于烧火做饭以及喂养牲口，而大多数秸秆则直接被焚烧，不仅是能源的浪费，而且对环境造成了严重污染。近年来，国家一系列关于农作物秸秆综合利用的政策出台，推进了农作物秸秆利用的多途径化、合理化和效益化。现在农作物秸秆的再利用途径主要有以下几方面：①用于直接粉碎还田使农田更加肥沃;②用于制作草帘、草绳等日用品或工艺品;③用作多种食用菌的栽培基质;④用于制作建材基质;⑤代替煤矿进行发电以及用于腐解生成沼气，从而优化能源结构;⑥作为生物原料用于微生物发酵等行业从而产出其他工业产品，如氨基酸、维生素、乳酸等[2]。目前前5种秸秆利用途径已经形成初步规模的工业化或商业化，而作为生物原料用于微生物发酵尚处于研究阶段。
　　L-丙氨酸是人体血液中含量最高的一种非必需氨基酸，在食品、医药和日化用品等领域都有着广泛的应用[3]，市场对丙氨酸具有极大的需求量。目前丙氨酸的生产主要是通过微生物发酵，其生产原料是以小麦或玉米等粮食制成的葡萄糖，这不仅消耗大量经济粮食，而且形成了“与人争粮”的不利局面。水稻秸秆中含有大量能降解成葡萄糖或木糖的纤维素和半纤维素，而如何利用水稻秸秆代替小麦或玉米等粮食进行微生物发酵生产丙氨酸，其中关键技术在于如何有效处理秸秆使其充分降解成葡萄糖和木糖等还原糖，以及如何解除微生物在利用秸秆水解液过程还原糖中的葡萄糖对其他糖的分解代谢阻遏效应，即葡萄糖效应[4]。对于解除微生物在利用秸秆水解液的过程中存在的葡萄糖效应，一般通过基因工程技术对微生物进行改造。通过基因工程技术敲除大肠杆菌磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，PTS）[5]中的葡萄糖转运酶基因（ptsG）[6]以降低葡萄糖效应的研究已取得了一定的成果，在此基础上再敲除半乳糖转运系统中也能转运葡萄糖的D-半乳糖/D-葡萄糖结合蛋白基因（mglB）[7]，从而进一步降低葡萄糖效应的研究也已经展开，如江吉雄[8]通过敲除mglB基因，降低了混合糖发酵D-乳酸中的葡萄糖效应，使发酵周期缩短了40%左右，转化率提高了2.3%;许琼丹等[9]通过敲除mglB基因，也降低了混合糖发酵乙醇中的葡萄糖效应，使发酵周期缩短了36%左右，转化率提高了5.8%。
　　该研究以本实验室构建的ptsG基因缺陷菌株JH-B3为出发菌株，拟通过Red同源重组技术敲除mglB基因，从而构建 ptsG/mglB基因双缺陷菌株，使菌株利用水稻秸秆水解液发酵中的葡萄糖效应进一步降低，以缩短菌株利用水稻秸秆水解液发酵丙氨酸的发酵周期，进一步提高水稻秸秆的利用率和丙氨酸发酵效率，为实现以廉价的水稻秸秆工业化生产L-丙氨酸提供支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌株与质粒。
　　出发菌株为大肠杆菌工程菌ptsG基因缺陷菌株JH-B3（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔldhA，ΔptsG，ΔpflB∷alaD），此菌株能同时利用葡萄糖和木糖发酵产L-丙氨酸，由本实验室前期构建并保存。菌株JH-B6是通过Red同源重组技术在工程菌JH-B3基础上获得的ptsG/mglB基因双缺陷菌株。质粒pKD4（包含FRT-kan-FRT阅读框和Amp抗性基因）和质粒pKD46（包含编码Red重组系统的基因和Amp抗性基因）由本实验室保存。
　　1.1.2 水稻秸秆。
　　水稻秸秆来自武汉市江夏区农田，其中纤维素34.7%、半纤维素26.1%、木质素16.7%，测定方法参考文献[10]。
　　1.1.3 主要试剂与仪器。
　　主要试剂：CaCl2·2H2O（AR）、L-阿拉伯糖（AR）、醋酸鈉（AR）、卡那霉素、氨苄青霉素、10%磷酸溶液、1.3%氢氧化钠溶液、纤维素酶;主要仪器：电泳仪、凝胶自动成像仪、PCR仪、电转仪、高效液相色谱仪、赛得利斯发酵罐、生物传感仪。
　　1.1.4 培养基。
　　LB培养基：蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉20 g/L（固体）。
　　卡那抗性筛选培养基：LB固体培养基中加入50 mg/L氨苄青霉素。
　　诱导培养基：LB液体培养基中的糖换为20 g/L阿拉伯糖。
　　种子培养基：LB液体培养基，20 g/L葡萄糖。
　　发酵培养基：蛋白胨10 g/L、氯化钠5 g/L、酵母粉5 g/L、碳源为水稻秸秆水解液。
　　1.2 方法
　　1.2.1 水稻秸秆预处理。
　　将水稻秸秆经粉碎机粉碎后过80目筛，60 ℃下烘干至恒重，储存备用。称取100 g粉碎后的干秸秆，按质量体积比1∶10加入1.3%氢氧化钠溶液，混合均匀后55 ℃处理30 h[11]，离心保留上清液并用85%磷酸回调pH至6.0，残渣用水洗至中性后烘干。将烘干后的残渣按质量体积比1∶9加入10%磷酸溶液[12]，混合均匀后，放入高压蒸汽灭菌锅，125 ℃下处理90 min，然后50 ℃下再处理20 min。离心后的上清液用氢氧化钙调节pH至6.0后再过滤，滤液回调pH至6.0。将分别经过氢氧化钠和磷酸溶液处理所得的处理液混合均匀后备用。 　　1.2.2 秸秆预处理液的纤维素酶处理。
　　将“1.2.1”中所得的水稻秸秆预处理液按每10 g秸秆加入30 FPU酶量的纤维素酶，在pH=6.0、50 ℃和200 r/min的条件下进行纤维素酶水解反应60 h[11]。最后将水解液用旋转蒸发仪浓缩至体积为0.5 L，检测其中还原糖、葡萄糖和木糖的含量。
　　1.2.3 引物的设计。
　　根据mglB基因序列设计敲除引物P1和P2，如表1所示，该对引物5′端45 bp片段与mglB基因序列同源，表中下划线序列与质粒pKD4上FRT-kan-FRT阅读框序列同源，又根据扩增引物P1、P2设计了验证引物P3、P4，验证引物序列与扩增引物上mglB两侧各20 bp序列相同。
　　1.2.4 大肠杆菌工程菌E.coli JH-B6菌株构建。
　　以pKD4质粒为模板，用扩增引物P1、P2进行PCR扩增，以获得带有Kan抗性基因的敲除片段，用乙醇沉淀和切胶回收以纯化基因敲除片段。PCR反应条件：
　　95 ℃3 min预变性;95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃2 min，循环30次;72 ℃5 min延伸;4 ℃，∞。
　　用CaCl2法[13]将pKD46转化到E.coli JH-B3细胞中，获得E.coli JH-B3/pKD46单菌落，再将此单菌落转接至含2%阿拉伯糖的LB液体培养基中培养，30 ℃培养至其菌液OD600=0.4左右时，用无菌去离子水洗涤3次，弃去上清液，再用200 μL超纯水将E.coli JH-B3/pKD46的菌体重悬，取80 μL的重悬菌液和10 μL基因敲除产物混合进行电转，电转电压为2.5 kV，时间为4.9 ms。随后将电击后的菌液立即转移LB液体培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下复苏培养1 h，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，于37 ℃下恒温培养出单菌落。再挑取单菌落为模板，用验证引物P3、P4进行PCR验证（反应条件：95 ℃3 min预变性;95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃2 min，循环30次;72 ℃5 min延伸;4 ℃，∞）。若成功转化，命名为E.coli JH-B6。挑取E.coli JH-B6菌株在卡那霉素LB固体培养基连续培养8代以上，进行后续发酵试验。
　　1.2.5 发酵试验。
　　1.2.5.1
　　单糖发酵。参照“1.2.2”中所测得的水稻秸秆水解液中葡萄糖和木糖的浓度，按两者的浓度比例设置单糖发酵试验的初始葡萄糖浓度和初始木糖浓度，比较JH-B3和JH-B6发酵情况，以探究mglB基因敲除对单糖发酵L-丙氨酸的影响。
　　1.2.5.2 水稻秸秆水解液发酵。以蒸发浓缩至0.9 L的水稻秸秆水解液为发酵碳源，比较JH-B3和JH-B6的发酵情况，以探究mglB基因敲除对水稻秸秆水解液发酵L-丙氨酸的影响。
　　每次发酵试验进行3次平行试验，发酵体积0.5 L，接种量1%。发酵条件为转速200 r/min，温度37 ℃，pH 6.8，中和剂为26%的氨水。每隔固定时长取样并检测菌体OD600、糖含量和L-丙氨酸含量，并对比2种菌种利用糖的能力及产L-丙氨酸能力。
　　1.2.6 分析检测。
　　菌体生物量：722型可见分光光度计;还原糖：DNS法[14];葡萄糖：生物传感仪;
　　木糖：高效液相色谱法，色谱柱为Bio-Rad HPX87H，流动相为4 mmol/L H2SO4，流速为0.5 mL/min，柱温为40 ℃，示差检测器[15]。
　　L-丙氨酸：高效液相色谱法，色谱柱为依利特C18柱（ODS-BP 5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相为0.05 mol/L Na2HPO4，用磷酸调节pH至6.5，CH3OH和Na2HPO4溶液体积比为1∶9;流速为0.80 mL/min，温度为30 ℃，进样量为5 μL，紫外检测器，检测波长为210 nm[16]。
　　阿拉伯糖：高效液相色谱法，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H离子交换柱（300 mm×7.8 mm），流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min，柱温为45 ℃，进样量为10 μL，RID-20A型示差折光检测器[17]。
　　2 结果与分析
　　2.1 水稻秸秆水解液糖浓度检测结果
　　100 g水稻秸秆的水解液蒸发浓缩至0.5 L后，其中还原糖、葡萄糖和木糖的含量分别为104.8、66.2、32.6 g/L，其还原糖的产率为0.524 g/g（即每1 g水稻秸秆产出还原糖0.524 g），达到理论值的86%左右，大幅高于一次预处理加酶水解的50%～70%。由此可知，水稻秸秆经过磷酸和氢氧化钠两次预处理后再酶解可得到更多的还原糖，这是因为稻草秸秆中纤维素含量比半纤维素高，不利于稻草秸秆的糖化，且半纤维素更容易降解[18]，所以第一步氢氧化钠预处理通常得到较多的木糖，而葡萄糖很少。将氢氧化钠预处理固液分离后的残渣再用磷酸进行预处理，提高处理温度和压强，使纤维素进一步降解从而得到较多的葡萄糖，同时避免了木糖在第二步酸解中被降解成糠醛和乙酸等副产物。 　　2.2 mglB基因缺陷菌株的鉴定
　　以JH-B3菌株作为对照，以验证引物P3、P4对JH-B6菌株进行PCR验证。以扩增引物P1、P2经PCR得到的含卡那霉素抗性基因的敲除片段大小约为1 550 bp，设计的验证引物P3、P4（均20 bp）与基因敲除片段上P1、P2两端的20 bp序列相同，mglB基因自身长度约999 bp。
　　因此，用验证引物P3、P4经PCR扩增出的片段应为1 550 bp，与mglB自身长度相差约551 bp。试验结果如图1所示，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段与预期片段大小相符，说明mglB基因成功敲除。
　　2.3 2种菌株利用葡萄糖和木糖能力对比
　　JH-B3和JH-B6分别以60 g/L葡萄糖和30 g/L木糖为碳源发酵L-丙氨酸时，其发酵情况见图2。由图2A可知，当2种菌株以60 g/L葡萄糖为碳源发酵L-丙氨酸时，在生长方面，JH-B3和JH-B6能达到最大OD600，分别为7.02和7.84;在利用葡萄糖方面，JH-B3平均耗糖率为1.86 g/（L·h），而JH-B6平均耗糖率为1.49 g/（L·h），较JH-B3降低了19.9%;在产L-丙氨酸方面，JH-B3在32 h发酵结束，最终L-丙氨酸浓度为52.2 g/L，糖酸转化率为87.9%，而JH-B6在40 h发酵结束，最终L-丙氨酸浓度为51.9 g/L，糖酸转化率为87.1%，均略低于JH-B3。
　　由图2B可知，当2种菌株以30 g/L木糖为唯一碳源发酵L-丙氨酸时，在菌株生长方面，JH-B3和JH-B6能达到最大OD600，分别为6.36和7.53，且JB-B6的OD600始终大于JB-B3;在利用木糖方面，JH-B3的平均耗糖速率为0.34 g/（L·h），而JH-B6平均耗糖率为0.42 g/（L·h），较JH-B3增加了23.5%;在产L-丙氨酸方面，JH-B3在88 h发酵结束，最终L-丙氨酸浓度为25.9 g/L，糖酸转化率为86.3%，而JH-B6在72 h发酵结束，最终L-丙氨酸浓度为27.2 g/L，糖酸转化率为90.6%，均略高于JH-B3。
　　以上结果表明，在利用葡萄糖时，JH-B6在生长方面优于JH-B3，但糖酸转化率略低于JH-B3，其原因可能是，在发酵中后期JH-B6摄取的葡萄糖更多地用于菌株生长，但JH-B6利用葡萄糖能力却低于JH-B3;在利用木糖时，JH-B6在生长方面和利用木糖的能力均优于JH-B3。综上所述，mglB基因的敲除确实能有效降低菌株摄取利用葡萄糖的能力且有利于菌株生长;同时mglB基因的敲除也增强了菌株对木糖摄取利用的能力。
　　2.4 2种菌株利用水稻秸秆水解液能力对比
　　以水稻秸秆水解液作为发酵碳源，JH-B3和JH-B6的菌体生长情况、耗糖情况及L-丙氨酸产量见图3。由图3A可知，在菌体生长方面，JH-B3和JH-B6能达到最大OD600，分别为6.92和7.84;在40 h之前，JH-B3的生物量均略大于JH-B6的生物量，在40 h之后，JH-B6的生物量反超JH-B3。
　　圖3 菌株JH-B3和JH-B6在混合糖中的生长曲线（A）、耗糖（B）及L-丙氨酸产量（C）
　　Fig.3 Growth curves（A），sugar consumption（B）and Lalanine production（C）of strain JHB3 and JHB6 in mixed sugar
　　由图3B可知，在耗葡萄糖方面，JH-B3在40 h时耗尽葡萄糖，葡萄糖平均消耗速率为1.65 g/（L·h），而JH-B6在52 h时耗尽葡萄糖，平均速率为1.27 g/（L·h），较JH-B3下降了23.0%。在耗木糖方面，JH-B3在128 h耗尽木糖，平均消耗速率为0.25 g/（L·h），JH-B6在88 h耗尽木糖，平均消耗速率为0.37 g/（L·h），较JH-B3提高了48.0%。在总糖还原糖方面，JH-B3和JH-B6均是在发酵前期以消耗葡萄糖为主，速度较快，当葡萄糖被利用完后，两者均是以消耗木糖为主，速度较慢;JH-B3和JH-B6分别在128、88 h时基本耗尽还原糖，即JH-B6的发酵周期较JH-B3缩短了31.3%;JH-B3平均耗糖速率为0.82 g/（L·h），JH-B6平均耗糖速率为1.19 g/（L·h），相比于JH-B3增加了45.1%。
　　由图3C可知，在L-丙氨酸产量方面，JH-B3和JH-B6均是前期产L-丙氨酸较快，当葡萄糖消耗完后产L-丙氨酸较慢，与还原糖的消耗情况保持一致。菌株JH-B3和JH-B6最终L-丙氨酸产量分别为93.8、98.4 g/L，平均生产强度分别为0.73、1.12 g/（L·h），转化率分别为89.5%和93.9%，相比JH-B3，JH-B6的平均生产强度增加了53.4%，转化率提高了4.9%。
　　以上结果表明，在水稻秸秆水解液中，JH-B6在菌体生长上强于JH-B3;在利用糖方面，虽然JH-B6摄取利用葡萄糖的能力低于JH-B3，但其摄取利用木糖的能力远强于JH-B3，以致于在整体利用还原糖的能力上反而强于JH-B3，从而使JH-B6的发酵速率更快、发酵周期更短;在产L-丙氨酸方面，JH-B6的L-丙氨酸产量、生产强度和转化率均高于JH-B3。综上所述，mglB基因敲除，有利于菌株在水稻秸秆水解液中生长和发酵丙氨酸，并且降低葡萄糖对木糖等其他碳源的分解代谢阻遏效应，从而使发酵周期大幅缩短，提高了丙氨酸产率和发酵效率。 　　3 結论
　　水稻秸秆具有结构紧密的特点，其中主要成分纤维素具有高结晶度和难溶性等特点，使其与催化剂或酶的接触困难，不易被水解，而半纤维素比纤维素容易降解，通常一次预处理难以使纤维素充分降解，从而还原糖的产率较低。若对一次预处理后的残渣通过提高处理时间、温度等条件进行二次处理，理论上可以使水稻秸秆进一步降解，提高还原糖产率，从而提高丙氨酸发酵效率。
　　此次研究通过对水稻秸秆进行磷酸和氢氧化钠二次处理再结合纤维素酶水解，还原糖的产率为0.524 g/g，高达理论值的86%，符合预期目的。以大肠杆菌ptsG基因缺陷菌株JH-B3为出发菌株，通过敲除编码葡萄糖转运蛋白mglB基因后，成功构建了ptsG/mglB基因双缺陷菌株JH-B6。JH-B3和JH-B6分别以葡萄糖和水稻秸秆水解液发酵L-丙氨酸时，JH-B6葡萄糖的利用速率较JH-B3分别下降了19.9%和23.0%，与预期结果相符;在水稻秸秆水解液发酵中，JH-B6利用还原糖和木糖的速率较JH-B3分别提高了45.1%和48.0%，也与预期结果相符;但以木糖发酵时，JH-B6利用木糖的速率较JH-B3提高了23.5%，这与预期结果不同，在敲除ptsG的基础上再敲除mglB会直接影响大肠杆菌利用木糖的速率，其原因有待于进一步研究。该研究在ptsG基因缺陷菌株JH-B3基础上，进一步构建了ptsG/mglB双缺陷菌株JH-B6，在以水稻秸秆水解液发酵时，又进一步使发酵周期缩短了31.3%，并且使L-丙氨酸转率也提高4.9%，最终使菌株以水稻秸秆水解液发酵L-丙氨酸的效率得到了大幅度提升。
　　综上所述，ptsG/mglB基因双缺陷菌株JH-B6以水稻秸秆水解液发酵时，具有五碳糖利用效率高，L-丙氨酸转化率高和发酵周期短的特点，不仅大幅降低葡萄糖效应，而且还为利用农作物秸秆等木质纤维素工业化发酵生产L-丙氨酸提供了理论基础。
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