HPLC法快速分离和检测食品中碱性嫩黄O的含量探讨
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摘要：本文使用HPLC法快速分离和检测食品中碱性嫩黄O的含量 ，该方法具有简便快速、重复性好、回收率高的特点。
关键词：碱性嫩黄O快速分离 HPLC法检测
1 前言
碱性嫩黄O，英文名称Auramine O。分子式C17H22N3Cl ，相对分子量303.83，黄色粉末状物质。难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和乙醇。碱性嫩黄只能用作工业染料，人体接触或者吸入都会引起中毒。由于能起染色作用，一些不法商贩把碱性嫩黄加入到豆制品中。快速分离和检测食品中碱性嫩黄O的含量，是我们食品检验工作者最重要的职责。
目前关于豆制品中碱性嫩黄O的检测尚无国家标准,相关的研究报道也比较少。采用福建省地方标准（DB35/T879―2009HPLC）法检测碱性嫩黄O的时候，出峰时间长而且分离效果不理想，不能快速有效地得到科学的检测数据。我所利用检验室现有的仪器进行了系列的实验，摸索到了比较理想的检测条件，其出峰时间大大缩短，分离效果也比较理想。以下就是我们的实验方法和过程，提出来和大家一起探讨。
2实验
2.1原理
试样通过酸化甲醇及超声波提取，正已烷净化，高效液相色谱紫外检测器检测食品中碱性嫩黄O的含量，外标法定量。
2.2 试剂和材料
2.2.1除另有说明外，所用试剂均为分析纯，试验用水为符合GB/T6682规定的一级水。
2.2.2甲醇：色谱纯。
2.2.3乙腈：色谱纯。
2.2.4氨水：优级纯。
2.2.5甲酸：优级纯。
2.2.6酸化甲醇：500ml甲醇+10ml甲酸。
2.2.7甲醇饱和正已烷：正已烷加少量甲醇,至分层出现。
2.2.8碱性嫩黄O标准品（Auramine O，C17H22N3Cl,分子量为303.83，纯度≥98%）。
2.2.9碱性嫩黄O标准储备溶液：准确称取20.0mg碱性嫩黄O标准品，用甲醇（2.2.2）溶解定容到100ml,配制成200μg/ml的标准溶液，4℃冰箱放置，3个月内使用。
2.2.10碱性嫩黄O标准溶液：准确移取适量的标准储备溶液（2.2.9），用酸化甲醇（2.2.6 ）稀释成0、1、3、6、12μg/ml的标准系列。4℃冰箱放置，一周内使用。
2.3 仪器
2.3.1U3000液相色谱仪：带紫外检测器。
2.3.2万能粉碎机。
2.3.3超声波发生器。
2.3.4高速离心机：15000r/min。
2.3.5分析天平（感量0.1mg和0.1g）。
3方法
3.1试样制备和保存
取有代表性样品500 g，用粉碎机或匀浆机粉碎，混匀，分成2份，装入洁净容器内，密封并标识。
3.2 试样的提取净化
称取5g（精确到1mg）试样，置于50mL离心管中，准确加入20.0mL酸化甲醇（3.2.9），超声提取30min；于4℃，10000r/min离心5分钟，移取5.0mL上清液于50mL离心管中，用甲醇饱和正己烷（3.2.11）萃取净化3次，每次2 mL，吸出正己烷层弃去，40℃氮气吹至2 mL以下，用酸化甲醇（3.2.10）定容到2.0mL，混匀，用0.2μm滤膜过滤后检测。
3.3 高效液相色谱条件
a) 色谱柱：ODS－C18色谱柱，5μm，250×4.6mm（内径）；
b) 流动相：0.1%甲酸乙腈溶液+丙酮（80+20）；
c) 流速：1ml/min；
d) 柱温：30℃；
e) 检测器：紫外检测器；检测波长：436nm；
f) 进样量：20μl。
3.4 定量测定
外标法定量：以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，标准品色谱图见图A.。
5 结果与讨论
5.1 回收率
回收率范围在:90.5%~110%。
5.2 线性关系
不同浓度碱性嫩黄O的峰面积
峰面积 浓度 1μg/ml 3μg/ml 6μg/ml 12μg/ml
1.580 3.274 5.755 10.703
结果表明,最终溶液中碱性嫩黄O浓度在1～12μg/ml范围,峰面积A与浓度C成线性关系,回归方程为A = 0.828C+ 0.774,相关系数为0.9997。置信度达到99.9%。
5.4 小结
本次采用酸化甲醇及超声波提取，正已烷净化，HPLC法快速分离和检测碱性嫩黄O, 回收率范围在:90.5%~110%范围。该方法快速简便,灵敏度比较高,干扰少,适用于豆制品中碱性嫩黄O的快速测定。
标准品色谱图 图A.
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