您好, 访客   登录/注册

HPLC法同时测定辣木叶颗粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的含量

来源:用户上传      作者:

  摘 要 目的:建立同时测定辣木叶颗粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B含量的方法。方法:采用高效液相色谱(HPLC)法。色谱柱为Cosmosil-C18,流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱),流速为1.3 mL/min,柱温为40 ℃,检测波长为260 nm,进样量为10 μL。结果:异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B检测质量浓度线性范围分别为0.017~0.341、0.010~0.194、0.010~0.195 mg/mL(r均>0.999 0);检测限分别为0.085、0.143、0.117 μg/mL;定量限分别为0.283、0.476、0.392 μg/mL;精密度、稳定性(24 h)、重复性试验的RSD均≤2.0%(n=6);平均加样回收率分别为101.22%、98.76%、98.72%,RSD分别为0.66%、0.30%、0.30%(n=6)。结论:建立的方法简便、准确、重复性好, 可用于同时测定辣木叶顆粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的含量。
  关键词 辣木叶颗粒;高效液相色谱法;异槲皮苷;紫云英苷;丹酚酸B;含量测定
  Simultaneous Determination of Isoquercitrin, Astragalin and Salvianolic Acid B in Moringa oleifera Leaves Granules by HPLC
  YANG Haiyang1,LIU Yang1,LI Mengwei1,LI Xueyan1,HE Jun2,GU Wenhong2,YIN Jiyun2(1.College of TCM, Beijing University of TCM, Beijing 102488, China;2.Yunnan Tianyou Technology Co., Ltd., Yunnan Mangshi 678400, China)
  ABSTRACT OBJECTIVE: To establish a method for simultaneous determination of isoquercitrin, astragalin and salvianolic acid B in Moringa oleifera leaves granules. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Cosmosil-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (gradient elution) at flow rate of 1.3 mL/min. The column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was set at 260 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS: The linear ranges of isoquercitrin, astragalin and salvianolic acid B were 0.017-0.341, 0.010-0.194, 0.010-0.195 mg/mL, respectively (all r>0.999 0). The detection limits were 0.085, 0.143, 0.117 μg/mL, and the limits of quantitation were 0.283, 0.476, 0.392 μg/mL, respectively. RSDs of precision, stability (24 h) and reproducibility tests were all lower than 2.0% (n=6). Average recoveries were 101.22%, 98.76% and 98.72%, and RSDs were 0.66%,0.30%,0.30% (n=6), respectively. CONCLUSIONS: The established method is simple, accurate and reproducible. It can be used for simultaneous determination of isoquercitrin, astragalin and salvianolic acid B in M. oleifera leaves granules.
  KEYWORDS Moringa oleifera leaves granules; HPLC; Isoquercitrin; Astragalin; Salvianolic acid B; Content determination
  辣木叶颗粒是根据《校注妇人良方》中天王补心丹组方制备而来,由辣木叶、酸枣仁、丹参、远志、五味子5味中药制备而成。其中,辣木叶是辣木科辣木属辣木(Moringa oleifera Lam.)的干燥叶,具有改善睡眠的作用[1];酸枣仁可养心肝之血,进而起到安神的作用,是治疗失眠复方中使用最多的一味药材[1-2],具有镇静催眠[3]、对抗神经系统兴奋[4]、宁心安神的作用;丹参具有活血凉血、养血安神的作用[5-6];远志具有交通心神、强志安神的作用;五味子具有敛心气、养心阴的作用,与酸枣仁合用可养心除烦,镇静安神[7-8]。本课题组根据处方,制备辣木叶颗粒,然后采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定辣木叶颗粒中君药辣木叶有效成分异槲皮苷、紫云英苷[9]和丹参中的丹酚酸B[10-11]的含量,以期为辣木叶颗粒的质量控制和进一步研究提供参考。   1 材料
  1.1 仪器
  LC-16 HPLC仪(日本岛津公司);SB-5200DT超声波清洗仪器(宁波新芝生物科技股份有限公司);CPA225D电子分析天平(德国赛多利斯公司);DZTW电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发仪(北京佳源兴业科技有限公司);DZ-2BC真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
  1.2 药品与试剂
  辣木叶(云南天佑科技开发有限公司,批号:160824)、远志(批号:1702048)、五味子(批号:1702047)、丹参(批号:1701027)、酸枣仁(批号:1503009)均购自北京太阳树康中药饮片厂,经北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为真品;异槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111809-201403,纯度:92.9%);紫云英苷对照品(上海源叶生物科技有限公司,批号:Y27J7H9634,纯度:99.5%);丹酚酸B对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:ST00050120MG,纯度:99.5%);甲醇、磷酸为分析纯,乙腈为色谱纯,水为娃哈哈纯净水。
  2 方法与结果
  2.1 辣木叶颗粒的制备
  按处方量称取辣木叶、酸枣仁、丹参、五味子、远志适量,加入10倍量水回流提取2次,每次2 h,过滤,静置过夜,滤去沉淀,旋转蒸发浓缩至一定体积,得浓缩液;60 ℃水浴浓缩至浸膏,移置60 ℃真空干燥箱中减压干燥,粉碎得干浸膏粉(得率为36.02%)。以乳糖为辅料,干浸膏粉与乳糖的质量比为1 ∶ 1,润湿剂为80%乙醇适量,混合,制粒,干燥,即得辣木叶颗粒。本研究共制备6批样品,批号分别为20170901、20170902、20170903、20170904、20170905、20170906。
  2.2 色谱条件
  色谱柱为Cosmosil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~16 min,20%A;16~30 min,40%A,30~36 min,20%A);流速为1.3 mL/min;柱温为40 ℃;检测波长为260 nm;进样量为10 μL。
  2.3 溶液的制备
  2.3.1 混合对照品溶液 取异槲皮苷10.56 mg、紫云英苷10.16 mg、丹酚酸B 10.23 mg,分別置于10 mL的量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,得对照品贮备液。精密吸取异槲皮苷贮备液1.74 mL、紫云英苷贮备液0.94 mL、丹酚酸B 0.96 mL于5 mL的量瓶中,加甲醇定容至刻度,混匀,即得混合对照品溶液。
  2.3.2 供试品溶液 取辣木叶颗粒样品 1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50 mL 70%甲醇溶液,称质量;超声(功率:250 W,频率:33 kHz) 30 min后取出,放冷,称质量,加入甲醇补足质量,摇匀,即得。
  2.3.3 阴性对照品溶液 精密称取乳糖1.0 g,并按“2.3.2”项下方法制备成辣木叶颗粒阴性样品溶液。
  2.4 专属性试验
  取“2.3”项下混合对照品溶液、供试品溶液(批号:20170901)、阴性对照品溶液适量,按“2.2”项下的色谱条件进样分析,记录色谱图。结果,异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B与其他成分色谱峰均能完全分离,分离度均>1.5,理论板数以异槲皮苷计不低于13 000。高效液相色谱图见图1。
  2.5 线性关系考察
  将“2.3.1”项下的混合对照品溶液定量稀释成含异槲皮苷0.017、0.034、0.051、0.068、0.085、0.128、0.171、0.341 mg/mL,紫云英苷0.010、0.019、0.029、0.039、0.049、0.073、0.097、0.194 mg/mL,丹酚酸B 0.010、0.020、0.029、0.039、0.049、0.073、0.098、0.195 mg/mL的系列浓度混合对照品溶液,按“2.2”项下的色谱条件进样分析,以待测成分质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归,线性关系考察结果见表1。
  2.6 检测限与定量限考察
  取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量,倍比稀释,按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。当信噪比为3 ∶ 1时,得检测限;当信噪比为10 ∶ 1时,得定量限。结果,异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的检测限分别为0.085、0.143、0.117 μg/mL;异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的定量限分别为0.283、0.476、0.392 μg/mL。
  2.7 精密度试验
  精密量取“2.3.2”项下供试品溶液适量,按“2.2”项下色谱条件进样分析,记录峰面积。结果,异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的峰面积的RSD分别为1.17%、1.37%、0.69%(n=6),表明仪器精密度良好。
  2.8 稳定性试验
  精密量取“2.3.2”项下供试品溶液适量,分别于室温下放置0、4、6、8、12 、24 h后,按照“2.2”的色谱条件进样分析,记录峰面积。结果,异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的峰面积的RSD分别为1.07%、1.67%、0.60%(n=6)。表明供试品溶液样品在24 h内稳定性良好。
  2.9 重复性试验
  精密称取辣木叶颗粒(批号:20170901)1 g,按“2.3.2”项下方法制备样品6份,按“2.2”项下色谱条件进样分析,记录峰面积。结果,异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.50%、0.54%、0.85%(n=6),表明该方法的重复性良好。   2.10 加样回收率试验
  精密称取辣木叶颗粒(批号:20170902)0.5 g,共6份,各加入约与样品中异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B 3种成分含量相同的对照品于具塞锥形瓶中,再分别精密加入50 mL 70%甲醇溶液,按“2.3.2”项下方法制备样品溶液,按“2.2”项下色谱条件进样分析,记录峰面积并计算加样回收率。结果,异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B平均加样回收率分别为101.22%、98.76%、98.72%,RSD分别为0.66%、0.30%、0.30%(n=6)。回收率结果见表 2。
  2.11 样品测定结果
  精密称取6批辣木叶颗粒的样品约1 g,按“2.3.2”项
  3 讨论
  本课题组在制备辣木叶颗粒的供试品溶液时,为了使操作更加快捷、节约溶剂和时间,笔者对提取方法(超声提取和回流提取)、提取溶剂(纯甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、水)、提取时间(30、45、60 min)、提取次数(1、2、3次)进行综合考察。结果表明,辣木叶颗粒用超声提取和回流提取对待测成分提取率无影响,故优先选择超声提取;用70%甲醇提取的异槲皮苷和紫云英苷、丹酚酸B的提取率最高,故选择70%甲醇为提取溶剂。提取时间30、45、60 min,提取次数也对待测成分提取率无影响,故优先选择30 min提取1次。
  筆者前期也对异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B进行全波长扫描,发现异槲皮苷的最大吸收波长为297 nm,丁香酚在362 nm和266 nm波长下有较大吸收,丹酚酸B在 254 nm和 287 nm波长下有较大吸收;最后综合考虑3种指标成分色谱峰对称因子、分离度、响应值、基线噪音,以及检测方法对各含量范围样品的适用性、灵敏度等因素后,选择260 nm作为同时检测的波长。
  综上所述,本研究成功建立了同时测定辣木叶颗粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B含量的方法,且该法简便、准确、重复性好,可为辣木叶颗粒的质量评价提供参考依据。
  参考文献
  [ 1 ] PAL SK, MUKHERJEE PK, SAHA K, et al. Studies on some psychopharmacological actions of moringa oleifera lam.(moringaceae) leaf extract[J]. Phytotherapy Research,2015,10(5):402-405.
  [ 2 ] 赵曹文聪,海英,任路.基于数据挖掘中药复方治疗失眠用药规律分析[J].辽宁中医杂志,2018,45(9):1851- 1853.
  [ 3 ] 崔思娇,贾英,罗洁,等.酸枣仁镇静催眠活性部位的筛选[J].中国药房,2013,24(23):2128-2129.
  [ 4 ] 杨楠,叶晓川.酸枣仁汤的神经药理作用及分子机制研究进展[J].湖北中医药大学学报,2017,19(3):114-117.
  [ 5 ] 李雪君,姜肖,丁元庆.丁元庆辨治瘀热不寐用药规律分析[J].山东中医药大学学报,2017,41(1):13-17.
  [ 6 ] 尚丛珊,孟婷婷.酸枣仁-丹参炮制品镇静催眠作用及对失眠小鼠脑电图的影响[J].中西医结合心血管病电子杂志,2018,6(9):137-138.
  [ 7 ] 綦向军,陈腾宇,梁浩锐,等.基于中医传承辅助平台软件分析治疗失眠膏方的组方规律[J].中国药房,2018,29(23):3236-3240.
  [ 8 ] 陈金锋,高家荣,季文博,等.酸枣仁-五味子药对镇静催眠作用及机制研究[J].中药药理与临床,2013,29(4):128-131.
  [ 9 ] 朱宝生,陈军,余远江,等.辣木有效成分及其开发利用研究进展[J].轻工科技,2018,34(7):19-21,23.
  [10] 杜冠华,张均田.丹参现代研究概况与进展(续一)[J].医药导报,2004,23(6):355-360.
  [11] 陈旭青,陈醒,吴苏亚,等.超高效液相色谱法对丹参不同部位化学成分的研究[J].安徽医药,2018,22(11):2096-2099.
  (收稿日期:2018-10-08 修回日期:2019-01-27)
  (编辑:唐晓莲)
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-14832960.htm

服务推荐