HPLC法同时测定辣木叶颗粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的含量

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　　摘 要 目的：建立同时测定辣木叶颗粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B含量的方法。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法。色谱柱为Cosmosil-C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.3 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为260 nm，进样量为10 μL。结果：异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B检测质量浓度线性范围分别为0.017～0.341、0.010～0.194、0.010～0.195 mg/mL（r均>0.999 0）；检测限分别为0.085、0.143、0.117 μg/mL；定量限分别为0.283、0.476、0.392 μg/mL；精密度、稳定性（24 h）、重复性试验的RSD均≤2.0%（n=6）；平均加样回收率分别为101.22%、98.76%、98.72%，RSD分别为0.66%、0.30%、0.30%（n=6）。结论：建立的方法简便、准确、重复性好， 可用于同时测定辣木叶顆粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的含量。
　　关键词 辣木叶颗粒；高效液相色谱法；异槲皮苷；紫云英苷；丹酚酸B；含量测定
　　Simultaneous Determination of Isoquercitrin， Astragalin and Salvianolic Acid B in Moringa oleifera Leaves Granules by HPLC
　　YANG Haiyang1，LIU Yang1，LI Mengwei1，LI Xueyan1，HE Jun2，GU Wenhong2，YIN Jiyun2（1.College of TCM， Beijing University of TCM， Beijing 102488， China；2.Yunnan Tianyou Technology Co.， Ltd.， Yunnan Mangshi 678400， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of isoquercitrin， astragalin and salvianolic acid B in Moringa oleifera leaves granules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Cosmosil-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at flow rate of 1.3 mL/min. The column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was set at 260 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of isoquercitrin， astragalin and salvianolic acid B were 0.017-0.341， 0.010-0.194， 0.010-0.195 mg/mL， respectively （all r>0.999 0）. The detection limits were 0.085， 0.143， 0.117 μg/mL， and the limits of quantitation were 0.283， 0.476， 0.392 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. Average recoveries were 101.22%， 98.76% and 98.72%， and RSDs were 0.66%，0.30%，0.30% （n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate and reproducible. It can be used for simultaneous determination of isoquercitrin， astragalin and salvianolic acid B in M. oleifera leaves granules.
　　KEYWORDS Moringa oleifera leaves granules； HPLC； Isoquercitrin； Astragalin； Salvianolic acid B； Content determination
　　辣木叶颗粒是根据《校注妇人良方》中天王补心丹组方制备而来，由辣木叶、酸枣仁、丹参、远志、五味子5味中药制备而成。其中，辣木叶是辣木科辣木属辣木（Moringa oleifera Lam.）的干燥叶，具有改善睡眠的作用[1]；酸枣仁可养心肝之血，进而起到安神的作用，是治疗失眠复方中使用最多的一味药材[1-2]，具有镇静催眠[3]、对抗神经系统兴奋[4]、宁心安神的作用；丹参具有活血凉血、养血安神的作用[5-6]；远志具有交通心神、强志安神的作用；五味子具有敛心气、养心阴的作用，与酸枣仁合用可养心除烦，镇静安神[7-8]。本课题组根据处方，制备辣木叶颗粒，然后采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定辣木叶颗粒中君药辣木叶有效成分异槲皮苷、紫云英苷[9]和丹参中的丹酚酸B[10-11]的含量，以期为辣木叶颗粒的质量控制和进一步研究提供参考。 　　1 材料
　　1.1 仪器
　　LC-16 HPLC仪（日本岛津公司）；SB-5200DT超声波清洗仪器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CPA225D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；DZTW电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（北京佳源兴业科技有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　辣木叶（云南天佑科技开发有限公司，批号：160824）、远志（批号：1702048）、五味子（批号：1702047）、丹参（批号：1701027）、酸枣仁（批号：1503009）均购自北京太阳树康中药饮片厂，经北京中医药大学中药鉴定系张贵君教授鉴定为真品；异槲皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111809-201403，纯度：92.9%）；紫云英苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y27J7H9634，纯度：99.5%）；丹酚酸B对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：ST00050120MG，纯度：99.5%）；甲醇、磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。
　　2 方法与结果
　　2.1 辣木叶颗粒的制备
　　按处方量称取辣木叶、酸枣仁、丹参、五味子、远志适量，加入10倍量水回流提取2次，每次2 h，过滤，静置过夜，滤去沉淀，旋转蒸发浓缩至一定体积，得浓缩液；60 ℃水浴浓缩至浸膏，移置60 ℃真空干燥箱中减压干燥，粉碎得干浸膏粉（得率为36.02%）。以乳糖为辅料，干浸膏粉与乳糖的质量比为1 ∶ 1，润湿剂为80%乙醇适量，混合，制粒，干燥，即得辣木叶颗粒。本研究共制备6批样品，批号分别为20170901、20170902、20170903、20170904、20170905、20170906。
　　2.2 色谱条件
　　色谱柱为Cosmosil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～16 min，20%A；16～30 min，40%A，30～36 min，20%A）；流速为1.3 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为260 nm；进样量为10 μL。
　　2.3 溶液的制备
　　2.3.1 混合对照品溶液 取异槲皮苷10.56 mg、紫云英苷10.16 mg、丹酚酸B 10.23 mg，分別置于10 mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得对照品贮备液。精密吸取异槲皮苷贮备液1.74 mL、紫云英苷贮备液0.94 mL、丹酚酸B 0.96 mL于5 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，即得混合对照品溶液。
　　2.3.2 供试品溶液 取辣木叶颗粒样品 1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇溶液，称质量；超声（功率：250 W，频率：33 kHz） 30 min后取出，放冷，称质量，加入甲醇补足质量，摇匀，即得。
　　2.3.3 阴性对照品溶液 精密称取乳糖1.0 g，并按“2.3.2”项下方法制备成辣木叶颗粒阴性样品溶液。
　　2.4 专属性试验
　　取“2.3”项下混合对照品溶液、供试品溶液（批号：20170901）、阴性对照品溶液适量，按“2.2”项下的色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B与其他成分色谱峰均能完全分离，分离度均>1.5，理论板数以异槲皮苷计不低于13 000。高效液相色谱图见图1。
　　2.5 线性关系考察
　　将“2.3.1”项下的混合对照品溶液定量稀释成含异槲皮苷0.017、0.034、0.051、0.068、0.085、0.128、0.171、0.341 mg/mL，紫云英苷0.010、0.019、0.029、0.039、0.049、0.073、0.097、0.194 mg/mL，丹酚酸B 0.010、0.020、0.029、0.039、0.049、0.073、0.098、0.195 mg/mL的系列浓度混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样分析，以待测成分质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，线性关系考察结果见表1。
　　2.6 检测限与定量限考察
　　取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限；当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限。结果，异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的检测限分别为0.085、0.143、0.117 μg/mL；异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的定量限分别为0.283、0.476、0.392 μg/mL。
　　2.7 精密度试验
　　精密量取“2.3.2”项下供试品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的峰面积的RSD分别为1.17%、1.37%、0.69%（n=6），表明仪器精密度良好。
　　2.8 稳定性试验
　　精密量取“2.3.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、4、6、8、12 、24 h后，按照“2.2”的色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的峰面积的RSD分别为1.07%、1.67%、0.60%（n=6）。表明供试品溶液样品在24 h内稳定性良好。
　　2.9 重复性试验
　　精密称取辣木叶颗粒（批号：20170901）1 g，按“2.3.2”项下方法制备样品6份，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.50%、0.54%、0.85%（n=6），表明该方法的重复性良好。 　　2.10 加样回收率试验
　　精密称取辣木叶颗粒（批号：20170902）0.5 g，共6份，各加入约与样品中异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B 3种成分含量相同的对照品于具塞锥形瓶中，再分别精密加入50 mL 70%甲醇溶液，按“2.3.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算加样回收率。结果，异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B平均加样回收率分别为101.22%、98.76%、98.72%，RSD分别为0.66%、0.30%、0.30%（n=6）。回收率结果见表 2。
　　2.11 样品测定结果
　　精密称取6批辣木叶颗粒的样品约1 g，按“2.3.2”项
　　3 讨论
　　本课题组在制备辣木叶颗粒的供试品溶液时，为了使操作更加快捷、节约溶剂和时间，笔者对提取方法（超声提取和回流提取）、提取溶剂（纯甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、水）、提取时间（30、45、60 min）、提取次数（1、2、3次）进行综合考察。结果表明，辣木叶颗粒用超声提取和回流提取对待测成分提取率无影响，故优先选择超声提取；用70%甲醇提取的异槲皮苷和紫云英苷、丹酚酸B的提取率最高，故选择70%甲醇为提取溶剂。提取时间30、45、60 min，提取次数也对待测成分提取率无影响，故优先选择30 min提取1次。
　　筆者前期也对异槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B进行全波长扫描，发现异槲皮苷的最大吸收波长为297 nm，丁香酚在362 nm和266 nm波长下有较大吸收，丹酚酸B在 254 nm和 287 nm波长下有较大吸收；最后综合考虑3种指标成分色谱峰对称因子、分离度、响应值、基线噪音，以及检测方法对各含量范围样品的适用性、灵敏度等因素后，选择260 nm作为同时检测的波长。
　　综上所述，本研究成功建立了同时测定辣木叶颗粒中异槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B含量的方法，且该法简便、准确、重复性好，可为辣木叶颗粒的质量评价提供参考依据。
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　　（收稿日期：2018-10-08 修回日期：2019-01-27）
　　（编辑：唐晓莲）
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