丹参酚酸B对过氧化氢引起的黑素细胞凋亡的保护作用研究

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　　[摘要]目的：研究丹参酚酸B对过氧化氢（H2O2）诱导的人表皮黑素细胞氧化应激及凋亡的保护作用。方法：采用MTT法检测H2O2对黑素细胞的活力抑制作用及丹参酚酸B的保护作用;Annexin-V/PI双染流式细胞术检测H2O2诱导黑素细胞凋亡的作用及丹参酚酸B的保护作用;DCFH-DA法流式细胞术检测H2O2促进黑素细胞活性氧簇（ROS）生成的作用及丹参酚酸B的抗氧化效果。结果：250μmol/L H2O2作用于黑素细胞24h可明显降低细胞活力、增加凋亡。0.6～10μmol/L丹参酚酸B预处理1h可明显保护黑素细胞，减少H2O2诱导的黑素细胞活力降低及凋亡。H2O2作用2h可显著诱导ROS生成，而丹参酚酸B可显著抑制H2O2诱导的ROS生成。结论：丹参酚酸B可能抑制活性氧生成，减少H2O2引起的黑素细胞凋亡，因而可能具有成为治疗白癜风新药的前景。
　　[关键词]丹参酚酸B;过氧化氢;黑素细胞;凋亡;氧化应激;白癜风
　　[中图分类号]R329.2+8    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）06-0064-03
　　Abstract： Objective  To test the effects of magnesium tanshinoate B on H2O2-induced oxidative stress and apoptosis in human epidermal melanocytes. Methods  Effects of H2O2 and magnesium tanshinoate B on cell viability were tested by MTT assay. The apoptosis of melanocytes were detected by annexin-V/PI staining cytometry analysis. ROS generation was measured by cytometry analysis with DCFH-DA method. Results  The cell viability of melanocytes deceased and apoptosis rate and ROS generation increased after treated with 250μmol/L H2O2 for 24h， while pretreatment with 0.6～10μmol/L magnesium tanshinoate B significantly alleviated the effects of H2O2.  Conclusions  Magnesium tanshinoate B alleviated H2O2-induced apoptosis in melanocytes probably by inhibiting the ROS generation according to its antioxidant ability， thus may have the potential to be used in treating vitiligo in the future.
　　Key words： magnesium tanshinoate B; H2O2; melanocyte; apoptosis; oxidative stress; vitiligo
　　白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，以黑素细胞缺失为主要特征，全球发病率约为0.5%～2%，严重影响患者身心健康[1]。本病发病机制尚不明确，但近年来氧化应激在白癜风发病机制中的作用越来越得到重视，氧化应激可能是引起白癜风黑素细胞死亡的重要原因[2]。因此，寻找有效的抗氧化剂成为治疗白癜风新的研究方向[3-4]。
　　丹参酚酸B（Magnesium tanshinoate B，MTB）是中药丹参的有效成分之一，来源于唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根茎，具有很强的抗氧化作用。近年体内外研究发现，丹参酚酸B具有强大的抑制脂质过氧化反应、清除氧自由基的作用，是目前已知最强的天然抗氧化产物之一[5]。但对于氧化应激引起的黑素细胞凋亡，丹参酚酸B是否也具有保护作用，目前尚不清楚。本研究利用过氧化氢诱导黑素细胞凋亡，来检测丹参酚酸B抗黑素细胞活性氧簇生成的作用，以及抑制黑素细胞凋亡的作用。
　　1  材料和方法
　　1.1 主要仪器及试剂：细胞系：人表皮黑素细胞株-中色素（HEM-m，美国sciencell公司）。主要试剂：丹参酚酸B（Magnesium tanshinoate B，南京森贝伽生物科技有限公司，中国）、30%过氧化氢（H2O2，Sigma，美国）、N-乙酰半胱氨酸（acetylcysteine，NAC，Sigma，美国）、胰蛋白酶（Gibico，美国）、乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma，美国）、四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma，美国）、二甲基亚砜（DMSO）、2'，7'-二氯氢化荧光素探针（DCF-DA，Sigma，美国）、TACS Annexin-V-FITC试剂盒（Trevigen，美国）、M254培养基及补充物（Cascade，美国）。主要儀器：自动酶标仪（Thermo，芬兰）、倒置显微镜（Nikon，日本）、流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 黑素细胞培养：人表皮黑素细胞株复苏后，以5×105/ml的密度接种于培养瓶中，以M254黑素细胞培养基5% CO2、37℃孵箱中培养，取第2～5代进入对数生长期细胞进行以下实验[3，6]。 　　1.2.2 细胞活力检测：采用四甲基偶氮唑蓝色法（MTT法）。以不同浓度的丹参酚酸B作为试验组，10mmol/L的NAC作为阳性对照组，只加H2O2为阴性对照组，不加任何药物处理作为空白对照组。黑素细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔板，每孔加细胞悬液100μl，每组设3个复孔，过夜贴壁后，首先测定丹参酚酸B的安全浓度，不同浓度的丹参酚酸B作用于黑素细胞24h，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl，培养4h后，弃上清，加100μl DMSO低速震荡5min，以波长490nm酶标仪测定吸光度值[6]。计算出安全浓度范围后，加入丹参酚酸B或NAC预处理1h，再加入250μmol/L的H2O2，37℃孵箱作用24h。
　　1.2.3 Annexin-V/PI双染法流式细胞术凋亡检测：细胞分组及处理同上。按TACS Annexin-V-FITC试剂盒说明操作，培养细胞消化、离心，每个样本加入FITC荧光标记的Annexin-V和PI各10μl，室温避光孵育10min，PBS洗3遍，流式细胞仪上机检测Annexin-V和PI阳性细胞比例[6]。
　　1.2.4 DCF-DA法活性氧簇含量检测：培养的黑素细胞加入10μmol/L丹参酚酸B或10mmol/L的NAC预处理1h，再加入250μmol/L的H2O2作用24h，空白对照组及阴性对照组处理同上。再加入10μmol/L DCF-DA，37℃孵箱中孵育30min，消化收集细胞，用预冷的PBS冲洗3次，波长488/525nm流式细胞仪上机检测荧光强度[6]。
　　1.2.5 统计学分析：数据以（x?±s）表示，应用SPSS 13.0统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析。
　　2  结果
　　2.1 丹参酚酸B减少H2O2引起的黑素细胞活力降低：不同浓度的丹参酚酸B作用于黑素细胞24h，当浓度≥20μmol/L时，细胞活力明显低于空白对照组（见图1），故选择≤10μmol/L浓度进行后续实验。250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞24h，可明显减少细胞活力。0.6～10μmol/L丹参酚酸B预处理1h可呈浓度依赖性增加细胞活力，抑制H2O2引起的黑素细胞死亡，0.3μmol/L的丹参酚酸B则无明显保护作用（见图2）。
　　2.2 丹参酚酸B减少H2O2引起的黑素细胞凋亡：250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞24h，可显著诱导黑素细胞凋亡。0.6～10μmol/L丹参酚酸B预处理1h可呈浓度依赖性减少H2O2诱导的细胞凋亡。见图3。
　　2.3 丹参酚酸B抑制H2O2诱导的ROS生成：250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞2h，可显著诱导黑素细胞ROS生成。10μmol/L丹参酚酸B预处理1h可明显抑制H2O2诱导ROS生成。见图4。
　　3  讨论
　　有多项证据表明白癜风患者存在明显的氧化应激表现。进展期白癜风患者表皮中H2O2水平显著升高，部分抗氧化酶水平低于正常[6-8]。皮损边缘及非皮损区表皮细胞膜脂质过氧化，活性氧簇（ROS）含量也高于正常[2，6，9]，患者外周血中也存在多种抗氧化酶的失衡[6，10-11]。近年来研究发现，白癜风皮损及边缘存在黑素细胞凋亡[1，6]，而氧化應激可能是引起黑素细胞凋亡的重要原因[2，6]。而体外实验也证明H2O2可诱导黑素细胞凋亡[4，6]。因此，本研究利用这一模型来检测抗氧化剂对黑素细胞的保护作用，筛选可能对白癜风治疗有效的抗氧化剂。研究结果表明：250μmol/L的H2O2可明显增加黑素细胞ROS含量，减少细胞活力，诱导凋亡。这些结果说明H2O2可稳定地激活黑素细胞氧化应激，诱导其凋亡，可以作为白癜风抗氧化药物筛选的细胞模型[6]。
　　丹参酚酸B具有两个羧基，是由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸缩合而成，具有强大的体内及体外抗氧化作用，既往研究显示其对心肌缺血再灌注损伤具有良好的保护作用[5]。因此，笔者推测丹参酚酸B也可能具有抗氧化应激，减少黑素细胞凋亡的作用。本研究结果显示：0.6～10μmol/L丹参酚酸B预处理1h可呈浓度依赖性减少H2O2引起的黑素细胞活力降低，减少黑素细胞凋亡。此外，研究结果还显示：丹参酚酸B可明显抑制H2O2诱导的黑素细胞ROS生成，抑制氧化应激，提示抗凋亡作用可能与其抗氧化作用相关。
　　综上所述，丹参酚酸B可能通过抗氧化抑制H2O2引起的黑素细胞凋亡，因而可能具有开发成为治疗白癜风新药的前景，其作用的分子机制有待进一步研究。
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　　[收稿日期]2019-02-02
　　本文引用格式：薛梅，張德利，刁庆春，等.丹参酚酸B对过氧化氢引起的黑素细胞凋亡的保护作用[J].中国美容医学，2019，28（6）：64-66.
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