柱前衍生反相高效液相色谱法测定血浆谷胱甘肽

来源:用户上传      作者: 陈利军 马芸香 贾莉 李爱国

　　[摘 要] 目的：建立一种柱前衍生反相高效液相色谱法测定血浆同型谷胱甘肽（glutath ione，GSH）的方法。方法：以tris-（2-carboxy lethy l）-phosphine（TCEP）为还原剂，7-fluorbenzo-2-oxa-1，3-diazole-4-sulfonate（SBD-F）为衍生剂，N-乙酰半胱氨酸（N-ace tylcystine，NAC）为内标，C8柱分离。流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液，梯度洗脱，激发波长（λex）380nm，发射波长（λem）510nm，内标标准曲线法定量。结论：本方法准确、灵敏、快速、特异，适合于GSH实验室研究和临床常规检测。
　　[关键词] 柱前衍生反相高效液相色谱法；谷胱甘肽
　　[Abstract] Objective Establish a pre-column derivatization RP-HPLC with plasma glutathione （glutath ione, GSH） method.Method With tris-（2-carboxy lethy l）-phosphine （TCEP） as reductant,7-fluorbenzo-2-oxa-1 ,3-diazole-4-sulfonate （SBD-F） as a derivative agent, N-acetyl cysteine acid （N-ace tylcystine, NAC） as an internal standard, C8 column separation. Mobile phase was methanol - phosphate buffer, gradient elution, the excitation wavelength （λex） 380nm, emission wavelength （λem） 510nm, internal standard quantification standard curve. Conclusion This method is accurate, sensitive, rapid, specific, suitable for laboratory research and clinical practice GSH detection.
　　[Keywords] Pre-column derivatization RP-HPLC; Glutathione
　　 1.材料和方法
　　1.1仪器与试剂：Ag ilent LC-1100高效液相色谱仪，附紫外检测器和荧光检测器；BOS-RYPERS IL-C8（150.0mm×4.6mm，5µm），保护柱及C18柱芯；GSH、Cys、CysGly、GSH、TCEP、N-乙酰半胱氨酸（N-acetlycysteine，NAC）、SBD-F。甲醇、EDTA・2K、磷酸二氢钾、硼砂、氢氧化钠、三氯乙酸、正磷酸等其他试剂均为国产分析纯。
　　1.2色谱条件：流动相：A相：25mmol/L，pH3.0的磷酸盐缓冲液；B相：甲醇；梯度洗脱程序：B相的体积变化分数为0～9min，5%～10%；9～10min，5%；柱温：30℃；流速：1ml/min；激发波长（λex）：380nm，发射波长（λem）：510nm。
　　1.3样品预处理与测定：还原：取标准溶液或血浆样品60µl加入10µl内标（NAC）液（800µmol/L）、10µlTCEP（120g/L）和20µl磷酸盐缓冲溶液（25mmol/L，pH7.4），（37.0±0.3） ℃水浴10min。蛋白沉淀：在还原后的溶液中加入90µl三氯乙酸（100g/L，含4mmol/LEDTA・2K），漩涡振荡混匀，4℃13000r/min离心10min。取上清液用于衍生。衍生及测定：在50µlSBD-F（1g/L，用0.125mol/L，pH9.5硼酸盐缓冲液配制，含4mmol/LEDTA・2K）中加入10µlNaOH溶液（1.5mmol/L），125µl硼酸盐缓冲液（0.125mol/L，pH9.5）和60µl经处理后的样品液，（70.0±0.5）℃水浴80min，立即置于碎冰上冷却10min，取25µl进样分析。
　　2.结果
　　2.1样品预处理条件的确定
　　2.1.1衍生剂量的确定：选择0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5g/L不同浓度SBD-F进行衍生化反应。结果表明，SBD-F浓度为0.8g/L时，衍生化反应基本完全，高于此浓度的各衍生物峰面积变化趋于稳定。选择衍生剂的浓度为1g/L。
　　2.1.2衍生化时间的确定：固定其他条件，取同一浓度标准品混合液分别衍生0、15、30、45、60、75、90、100min。结果表明，在0～60min内GSH和其他硫醇物衍生物峰面积随时间的延长而增加，60min后峰面积趋于稳定，反应基本完全。选择衍生化时间为80min。
　　2.1.3衍生化温度的确定：取同一浓度的混合标准溶液在25、37、50、60、70、80℃不同温度下进行衍生化反应。结果表明，衍生化反应温度对衍生物的产率有显著影响，衍生物峰面积随温度的升高而增加，超过60℃趋于稳定。选择衍生化温度为70℃。
　　2.1.4还原剂量的确定：取健康正常人混合血浆，在40、60、80、100、120、180g/L不同TCEP浓度下进行还原反应。结果表明， GSH衍生物与内标峰面积比值随TCEP的浓度增加而升高，120g/L时达到较高峰值。选择TCEP的浓度为120g/L。
　　2.1.5还原时间的确定：取健康人混合血浆各进行5、10、15、30、45、60min还原反应。结果表明，37.0℃水浴10min，GSH等硫醇衍生物与内标峰面积比值达到最大，其后趋于稳定。确定还原时间为10min。
　　2.2方法学评价
　　2.2.1精密度：取健康人混合血浆，加入不同体积的标准品混合液。经“样品预处理及测定”项下操作。日内重复测定5次，连续测定5d，见表1。结果表明本方法具有较好的精密度。
　　2.2.2回收率：对高、中、低不同浓度的血浆样品进行加标回收试验，相对回收率%=（血浆标准溶液浓度-未加标准液血浆浓度）/加入标准液浓度×100%。结果显示，各物质在不同浓度下均获得满意的回收率，CV均小于4.5%。
　　2.2.3标准曲线及最低检测限：配制一系列不同浓度的标准溶液。以标准品与内标峰面积之比对标准品的浓度绘制标准曲线，求得回归方程。以3倍信噪比（S/N=3）时样品浓度为最低检测限，见表2。
　　2.2.4稳定性：本研究结果表明，SBD-GSH、SBD-Cys、SBD2CysGly、SBD2GSH置于冷藏条件下至少可稳定1d；光照情况下可降低衍生物的荧光强度，因而衍生样品应避光保存。
　　3.讨论
　　血浆硫醇物大多以蛋白复合物形式存在。测定血浆硫醇物总浓度时需在样品衍生前进行还原处理。本研究选用TCEP作为还原剂，该物质稳定，能溶于水，受反应时间、温度和浓度的影响小， 比采用其他还原剂法有更好的重复性， 更适合常规分析。

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