环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究

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　　【摘 要】环境DNA（eDNA）技术是一种运用分子生物学的方法，通过从环境样品中提取DNA并进行测序和分析来反映物种信息的技术。eDNA技术具有灵敏度高、操作简便、对水生态系统干扰小等优点，因而被越来越多地运用到了水生生物监测和评价中。本文从eDNA技术的发展历程、研究方法和应用领域这三个方面对eDNA技术进行了综述，总结了eDNA技术的优缺点，并对其未来的发展前景进行了展望。
　　【关键词】环境DNA;分子生物学;水生生物监测
　　中图分类号： S932.4 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）22-0078-002
　　DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.22.034
　　0 引言
　　水生态系统是人类生存重要的自然资源之一。随着人类社会经济和工业化的发展，水生态系统遭到了越来越严重破坏。因而对水生态系统进行监测是非常重要的。水生生物是水生态系统中重要的组成部分。当污染物进入水体后，会产生一定的生态效应，对水生态环境造成破坏，影响水体中动植物的生长发育，进而对水生生物造成危害[1]。因此对水生生物开展监测能直观地反映水生态系统受污染的程度。
　　传统的水生生物监测方法是对浮游生物、底栖生物、鱼类等生物开展现场调查及采样，采用形态学方法对所采集到的物种进行定性和定量分析。传统水生生物监测方法具有一定的局限性，一些密度比较低的生物群体在现场采样时比较难以获得，分析结果也会因此而受到影响。且传统水生生物监测中的形态学鉴定方法对从事物种鉴定的人员技术要求较高，有时对于样本的完整性程度要求也比较高。因此，有必要寻找一种更为高效便捷的方法对水生生物物种进行鉴定和分析。
　　随着分子生物学技术的发展，分子生物学技术逐渐被应用到物种鉴定中。近些年在水生态环境监测领域里，环境DNA（environmental DNA， eDNA）分子技术正被越来越多的研究者们所应用。eDNA是指从环境中（如土壤、水、空气等）提取的所有DNA集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA[2-3]。以下从eDNA的发展历程、eDNA的技术方法、eDNA检测技术在水生生物监测中的应用、总结与展望这几个方面进行综述，为水生生物监测提供参考。
　　1 eDNA技术的发展历程
　　eDNA技术最早出现于环境微生物学领域，并在2000年之后逐渐得到认可和应用。Willerslev[4]等利用eDNA技术提取了不同国家和地区古老沉积物中的DNA，对生物多样性、动植物的组成及变化等进行了研究。Ficetola[5]等于2008年报导了利用eDNA技术检测淡水中一种蛙（Rana catesbeiana）的存在，这也是首次利用该技术对水生生物进行监测。随着eDNA技术的发展，其研究范围也逐渐扩大，从最初对于某一种生物的定性研究发展到定量研究，研究对象也从单一物种逐渐扩大到了两栖类、鱼类、哺乳类、爬行类等各类物种。eDNA技术的发展为水生生物的监测提供了新的方法。
　　2 eDNA研究方法
　　目前eDNA的主要研究方法有三种：PCR、荧光定量PCR和高通量测序。与传统的人工形态学方法相比，这三种方法具有省时省力的优势。PCR方法主要用于物种的定性检测，可检测水体中是否存在某一特定的物种。Goldberg等[6]使用PCR技术检测溪流中的洛基山尾蛙（Ascaphus montanus）和爱达荷州巨型火蜥蜴（Dicamptodon aterrimus）。荧光定量PCR法可以在定性检测物种是否存在的基础上，对物种的生物量进行预测。
　　高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称二代测序技术（next-generation sequencing， NGS），能够一次对几十万至几百万条DNA分子进行序列测定。NGS技术与eDNA技术相结合产生eDNA宏条形码（eDNA metabarcoding）技术。eDNA宏条形码技术通过从环境样品中提取DNA，借助第二代高通量测序获取其物种组成，进而探究群落水平上的生物多样性。孙晶莹等[7]以太湖流域常见的5种枝角类浮游动物为研究对象，建立了一种基于eDNA宏条形码技术的物种定量方法。赵梦迪[8]利用高通量测序技术检测了黄海南部和东海北部10个点位的鱼类多样性和丰度，发现所鉴定到的鱼类种类多为东黄海的常见品种，部分鱼类虽不是常见品种，但曾出现在东黄海的记录中，与此同时，通过该技术获得的各点位优势种与当次捕捞的优势种基本相同，证明eDNA技术与传统形态学分析法具有较好的一致性。
　　3 eDNA在水生生物监测中的应用
　　目标物种的检测物种入侵、濒危物种和稀有物种的保护是重要且亟待解决的生态问题之一。eDNA技术可通过检测水样中是否含有特定的DNA序列来判断某一物种是否存在。这使得原本复杂且耗时的工作变得高效省力。
　　3.1 对外来物种进行监测
　　外来物种入侵是21世纪5大全球性环境变化问题之一，也是全世界最为关注的焦点问题之一。外来物种一旦入侵成功，可能会与本土的物种形成竞争关系并成为优势种，对全球生物多样性带来影响。入侵成功的外来物种根除可能性很小且控制成本高，如果能對入侵物种提前进行监测，在早期就采取措施，那么就有可能提升根除成功率并降低控制成本。近些年来，eDNA技术已被逐渐用于外来物种的监测中，目前在全球范围内利用eDNA监测过的外来物种包括：美国牛蛙、大西洋鲑、亚洲鲤鱼、克氏螯虾、小龙虾、莫比鱼等物种。
　　3.2 对濒危和稀有物种进行监测
　　由于濒危物种或稀有物种密度低，所以传统的形态学鉴定方法很难对这些物种进行监测。且采用传统形态学方法时需要使用拖网、电捕鱼等采样工具，易对生态系统造成影响。eDNA技术与传统方法相比具有更好的灵敏度，且在实际操作时直接采集水样即可，因而能很好地避免这些问题，该技术特别适用于濒危物种和稀有物种的监测。目前eDNA技术已经实现了对欧白鲑、美国隐鳃鲵、王鲑、澳洲麦氏鲈等物种的监测。 　　生物多样性监测 生物多样性是衡量某一地区生物资源丰富程度的客观指标，对人类社会的生存和发展具有非常重要的意义。生物多样性不仅在保持土壤肥力、保证水质、调节气候、调控大气层成分地标温度等方面发挥了重要作用，而且生物多样性的维持有助于珍稀物种和濒危物种的保存。因此，许多国家和地区都开展了对生物多样性的监测和保护。传统的监测技术存在难以正确识别一些隐秘物种或幼年生命阶段物种的问题，因而需要寻找一种能够快速准确地进行生物多样性监测的技术。近年来，eDNA宏条形码技术被越来越广泛地应用到了生物多样性研究中。eDNA宏条形码技术是通过提取环境样品中的DNA，使用特异性引物进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序后得到的可操纵分类单元（operational taxonomic units， OTUs）进行物种鉴定来获知物种组成的[9]，从而可探究群落水平上的生物多样性。eDNA宏条形码技术很好地避开了传统生物多样性监测技术中的问题，快速、高效的特点使其成为了生物多样性监测较为理想的技术手段。Thomsen等[10]从丹麦的海洋生态系统中采集海水，利用eDNA宏条形码技术对海洋中鱼类的生物多样性开展了研究。研究共发现了15种鱼类，其中包括了用传统方法难以监测到的稀有物种。与9种用传统方法监测到的海洋鱼类进行比较，发现eDNA检测到的鱼类多样性与传统方法相当，这表明eDNA宏条形码技术具有水生生物多样性评价的潜力。
　　生物量的估算 生物量是重要的生物学参数之一，但要对其进行精确的估算通常比较困难。采用传统方法进行生物量估算时会对生态系统造成较大的损害。孙晶莹等[7]利用eDNA宏条形码技术对枝角类浮游动物开展了生物量的监测研究，建立了一种基于eDNA宏条形码技术的物种定量测定方法。研究结果发现，eDNA宏条形码技术可对浮游动物实现半定量监测，且eDNA宏条形码技术与qPCR结果具有较强的一致性，能较好地反映物种的丰度变化。一些学者运用eDNA技术对水生态系统中的两栖动物、鱼类等物种进行生物量估算，发现水温、pH、光照等因素会对eDNA的释放产生一定的影响，间接地影响了生物量的估算。因此，eDNA技术在生物量估算方面还需要更为深入的研究。
　　4 总结与展望
　　作为一种新型的水生生物监测技术，eDNA技术目前已在目标种的监测、生物多样性调查、生物量估算等方面得到了较为广泛的应用。与传统的生物监测技术相比，eDNA技术具有如下的优势：（1）灵敏度高：eDNA技术可用于密度很低的珍稀物种和濒危物种的定性监测，而传统方法很难准确地对低密度种群进行监测;（2）高效省时：与传统监测方法相比，eDNA技术通常所需的人力、物力和时间更少;（3）降低了对人员的要求：传统监测技术需要依靠形态学对物种进行定性、定量分析，这就要求研究人员具有很高的分类鉴定能力，而eDNA技术是只需使用分子生物学方法就可以进行物种鉴定，操作更为便捷;（4）采样受限小：传统的生物采样方法受天气、环境的影响较大，而使用eDNA技术时只需采集一定量的水样，受外界影响较小;（5）对水生生态系统干扰小：传统的生物采样方法需要使用捕捞工具，在捕捞生物时易对生态系统造成损害，而eDNA技术只采集水样，因而对生态系统干扰较小。
　　虽然eDNA技术在许多方面相比传统监测方法具有明显的优势，但依然在某些方面存在一定的问题与不足：（1）eDNA技术的结果判别需要依靠数据库，如果数据库中的生物信息不完备，那么最终检测结果将受到影响;（2）当样品在采集或运输过程中发生交叉污染，或是实验室分析过程中出现试剂污染问题时，eDNA的分析过程往往会受到影响，其分析结果也会有所偏差，因而在操作时所使用的工具、材料、设备等须提前进行灭菌处理，并在PCR扩增过程中添加去抑制剂;（3）某些环境因子可能会对eDNA的产生速率或降解速率造成影响，这将直接影响到最终的DNA量和定量研究的准确性，而目前仍无法完全确定哪些环境因子会影响eDNA的产生或降解速率，有待进一步的研究和考证;（4）eDNA技术的检测结果在时间和空间尺度上的精度较低，其检测精度还有待提升。
　　eDNA技术是以分子生物学为基础的一种简单高效的物种监测方法，与二代测序技术相结合后可展现出巨大的潜能。未来关于eDNA技术的研究应涉及以下几个方面：（1）明确影响eDNA产生和降解的环境因子和相应的机理;（2）建立eDNA与生物量之间的关系模型，实现利用eDNA技术对物种进行定量评估;（3）对生物多样性热点地区的eDNA进行分析，发挥并提升eDNA技术在生物多样性保护中的作用;（4）将eDNA技术应用到食物网、能量流动等研究中，进一步拓展其应用的领域。
　　【参考文献】
　　[1]国家环境保护总局.水和废水监测分析方法.第四版[M].北京：中国环境科学出版社，2002：11.
　　[2]Levy-Booth D J，Campbell R G，Gulden R H，et al.Cycling of extracellular DNA in the soil environment[J]. Soil Biology and Biochemistry，2007，39：2977-2991.
　　[3]Pietramellara G，Ascher J，Borgogni F，et al.Extracellular DNA in soil and sediment：fate and ecological relevance[J].Biology and Fertility of Soils，2009，45：219-235.
　　[4]Willerslev E，Hansen A J，Binladen J，et al.Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments[J]. Science，2003，300（5620）.
　　[5]Ficetola G F，Miaud C，Pompanon F，et al.Species detection using environmental DNA from water samples[J].Biology Letters，2008，4（4）.
　　[6]Goldberg C S，Pilliod D S，Arkle R S，et al.Molecular detection of vertebrates in stream water：a demonstration using Rocky Mountain tailed frogs and Idaho giant salamanders[J]. PLoS One，2011，6（7）.
　　[7]孫晶莹，杨江华，张效伟.环境DNA（eDNA）宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究[J].生态毒理学报，2018，13（05）：76-86.
　　[8]赵梦迪.利用环境DNA分析冬季中国东黄海水域的鱼类多样性[D].上海海洋大学，2017.
　　[9]Ji Y Q，Ashton L，Pedley S M，et al. Reliable，verifiable and efficient monitoring of biodiversity via metabarcoding.Ecology Letters，2013，16（10）：1245-1257.
　　[10]Thomsen P F，Kielgast J，Iversen L L，et al.Detection of a Diverse Marine Fish Fauna Using Environmental DNA from Seawater Samples[OL].（August 29th， 2012）.[July 8th，2019].
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