奶牛乳房炎病畜生鲜乳中大肠杆菌污染状况及耐药性分析

来源:用户上传      作者:邬元娟　张树秋　王文博　李鸳鸯

　　摘要：为了解奶牛乳房炎病畜生鲜乳中大肠杆菌污染状况及耐药性，于2019年从潍坊、青岛采集牛乳房炎病畜生鲜乳样品共计98份，对其中常见大肠杆菌的污染状况进行分析。结果表明，98份奶牛乳房炎病畜生鲜乳样品中，42份检出大肠杆菌，检出率为42.9%。对检出的大肠杆菌菌株进行10种抗生素的药敏试验，结果表明，检出的大肠杆菌对氨苄西林、多西环素、四环素有较高的耐药性，且多数为多重耐药菌株。综上，牛乳房炎病畜生鲜乳中大肠杆菌污染较为严重，建议相关部门进一步加强牛乳房炎病畜生鲜乳的监管，采取针对性风险监测措施。
　　关键词：奶牛乳房炎病畜;生鲜乳;大肠杆菌;污染状况;耐药性
　　中图分类号：S858.23：TS207.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）03-0121-04
　　AbstractIn the study， ninety-eight raw milk samples produced by dairy cattle with mastitis were collected from Weifang City and Qingdao City of Shandong Province in 2019. The contamination situation of Escherichia coli in raw milk samples and its antibiotic resistance were analyzed. The results showed that Escherichia coli was found in 42 samples with the detection rate as 42.9%. The results of the susceptibility tests of Escherichia coli strains to 10 types of antibiotics showed that the strains had higher antibiotic resistance to ampicillin， doxycycline and tetracycline， and most of them were multi-drug resistance strains. In conclusion， the contamination situation of Escherichia coli in raw milk produced by dairy cattle with mastitis in the researched areas were quite serious， so the relevant governmental departments should strengthen the supervision to fresh milk and implement the targeted risk monitoring measures.
　　KeywordsDairy Cattle with Mastitis; Raw milk; Escherichia coli; Contamination situation; Antibiotic resistance
　　乳房炎是奶牛的一种常见多发性疾病，是影响世界奶牛业发展的主要疾病之一，不仅严重影响奶牛的健康及生产能力，而且降低生鲜乳品质，严重时会导致奶牛乳区化脓坏死，丧失泌乳能力[1，2]，直接影响着奶牛养殖业的经济效益。世界奶牛协会调查数据统计称全世界约有1/3的奶牛患有各种类型乳房炎，大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的重要病源微生物[3-7]。目前奶牛乳房炎防治的主要措施是抗生素治疗，但由于长期盲目地使用抗生素，细菌耐药现象日益严重，治疗效果也愈来愈不理想。
　　本试验于2019 年对采自山东潍坊、青岛奶牛乳房炎病畜的生鲜乳样品进行大肠杆菌检测，并对检测出的大肠杆菌菌株进行抗生素药敏试验，以期为选择有效的抗菌药以防止抗生素滥用及研究食源性致病菌提供可靠依据，并为开展奶牛乳房炎病畜生鲜乳产品风险监测、完善奶牛乳房炎病畜生鲜乳致病菌防治体系奠定基础。
　　1材料与方法
　　1.1样品采集
　　在潍坊、青岛的奶场抽取患乳房炎奶牛的牛乳样品，共计98份。每份生鲜乳样品采集量为200 mL，无菌瓶封装后冷藏条件下4 h内送实验室检测。采样过程中遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
　　1.2主要试剂及设备
　　所用大肠杆菌增菌液、分离培养基及显色培养基均购自广东环凯生物科技有限公司，所有试剂及生化检定卡均在有效期内使用。生化培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司，质控菌株均由广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心提供，大肠杆菌质控菌株编号ATCC25922。
　　1.3检测方法
　　参照《食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157：H7/NM檢验》 （GB 4789.36—2016）[8]对样品中的大肠杆菌进行检测，检测过程严格按照《国家食源性致病菌监测工作手册》中质量控制操作程序进行，并以标准菌株为对照菌株进行质控。
　　1.4药敏试验方法
　　将分离并保存于-80℃冰箱的大肠杆菌菌株取出复苏，划线接种于营养琼脂板上，挑取菌落数个置于接种水（DEMINERALIZED WATER）中，用0.5麦氏比浊管比浊;取上述菌液60 μL，加入营养肉汤培养液中，混匀;吸取稀释菌液，加入药敏板中，毎孔100 μL;将板条放入恒温培养箱中36℃培养16～24 h后取出，判读各个孔的阴阳性结果。
　　1.5大肠杆菌药敏板及其浓度
　　氨苄西林（AM） 0.25～128 μg/mL，阿莫西林-克拉维酸（AMC） 0.25/0.12～128/64 μg/mL，庆大霉素（GEN）0.25～128 μg/mL，复方新诺明（T/S） 0.12/2.4～64/1 208 μg/mL，环丙沙星（CFX） 0.25～128 μg/mL，磺胺异恶唑（G）2～1 024 μg/mL，多西环素（DOX）0.25～128 μg/mL，卡那霉素（KAN） 0.5～256 μg/mL，美罗培南（EMP） 0.25～128 μg/mL，四环素（TET） 0.25～128 μg/mL，上海星佰生物技术有限公司。 　　2结果与分析
　　2.1奶牛乳房炎病畜生鲜乳产品中大肠杆菌检出总体情况
　　2019年采自潍坊、青岛的98份奶牛乳房炎病畜生鲜乳样品中，有42份检出大肠杆菌，大肠杆菌检出率为42.9% （42/98）。
　　2.2大肠杆菌药物敏感性试验结果分析与MIC值
　　按照CLSI M100S 26th Edtion 抗微生物药物敏感性试验的执行标准对分离到的42株大肠杆菌进行药敏试验。
　　2.2.1大肠杆菌菌株的多重耐药性情况42株大肠杆菌中有27株为耐药菌株，耐药菌株率为64.3%。27株耐药大肠杆菌中，6株菌耐一种抗生素，2株菌耐二种抗生素，1株菌耐三种抗生素，2株菌耐四种抗生素，2株菌耐五种抗生素，5株菌耐六种抗生素，5株菌耐七种抗生素，3株菌耐八种抗生素，1株菌耐九种抗生素（图1）。
　　2.2.2大肠杆菌耐药菌株对十种抗生素的耐药率由图2可见，分离到的27株大肠杆菌耐药菌株对氨苄西林（AM）、多西环素（DOX）、四环素（TET）的耐药率较高，达到47.6%;其次为磺胺异恶唑（G）、复方新诺明（T/S），分别为45.2%、40.5%;对环丙沙星（CFX）和庆大霉素（GEN）的耐药率也较高，分别为30.9%和21.4%。但对阿莫西林-克拉维酸（AMC）和美罗培南（EMP）的耐药率较低，分别为7.1%和2.4%。
　　
　　2.2.3大肠杆菌对十种抗生素的耐药谱27株大肠杆菌耐药菌株对十种抗生素的耐药谱见表1。
　　3讨论与结论
　　乳制品已经成为我国居民生活中不可或缺的食品，其食用安全得到国家及民众的极大关注。近年来乳源性致病菌的危害已经引起了相关政府部门和相关研究者的极大重视[9，10]。大肠杆菌是一种人畜共患病菌，可引起食物中毒。王晓等[2]对中国北方地区某奶牛场牛奶样品中大肠杆菌的耐药情况进行分析，发现所分离的28株大肠杆菌对苯唑西林和万古霉素的耐药率为100%，对35种抗生素共呈现16种多重耐药谱[7]。石润佳等[4]对华北地区乳房炎牛奶样中大肠杆菌耐药情况的分析表明，所分离的17株大肠杆菌菌株对青霉素、苯唑西林、林可霉素3种药物的耐药率高达100%，表现出高度耐药和多重耐药。许丹丹等收集新疆石河子地区乳房炎牛奶样并分析其大肠杆菌耐药情况，发现所分离的16 株大肠杆菌对阿莫西林、四环素均耐药。随着抗生素在畜牧业中的大量使用，大肠杆菌的耐药水平越来越高，耐药谱越来越广，多重耐药现象越来越严重。
　　本研究检测了2019年从潍坊、青岛采集的奶牛乳房炎病畜生鲜乳样品的大肠杆菌污染情况，并对检出的大肠杆菌菌株进行了10种抗生素药敏试验。结果发现，在98批次奶牛乳房炎病畜生鲜乳样品中，有42份检出了大肠杆菌;分离到的42株菌中有15株敏感菌株，27株耐药菌株，耐药菌株率为64.3%;这27株耐药菌对氨苄西林、多西环素、四环素耐药率最高，均为47.6%，而对阿莫西林-克拉维酸（AMC）和美罗培南（EMP）的敏感性较高。27株耐药菌均对一种、两种或多种抗生素耐药，其中19株为耐三种或三种以上抗生素的多重耐药菌株，耐6种抗生素的耐药组合氨苄西林（AM）+多西环素（DOX）+四环素（TET）+磺胺异恶唑（G）+复方新诺明（T/S）+环丙沙星（CFX）出现4次，耐7种抗生素的耐药组合氨苄西林（AM）+多西环素（DOX）+四环素（TET）+磺胺异恶唑（G）+复方新诺明（T/S）+卡那霉素（KAN）+庆大霉素（GEN）出现3次。因此，可以根据本研究结果选择有效抗大肠杆菌的药物，可以减少氨苄西林、多西环素、四环素的用药，而用阿莫西林-克拉维酸或美罗培南。
　　综合来看，本次奶牛乳房炎病畜生鲜乳样品的检出率较高，致病菌的多重耐药性也较高，希望有关部门加强监管，减少由此可能引发的食源性疾病。本研究发现检测出的大肠杆菌菌株对阿莫西林-克拉维酸和美罗培南的敏感性较高，耐药谱图也表现出了一些规律性，在多重耐药谱图中也出现了相似性，这为以后有效选择抗菌药、防止抗生素滥用及研究食源性致病菌提供了可靠依据，为完善乳制品致病菌防治体系奠定了基础。
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