不同采集地割手密种质资源的耐寒性评价

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　　摘  要  本研究对不同采集地割手密无性系进行耐寒性综合评价，探究割手密耐寒性与其生长地海拔、纬度的关系，筛选耐寒性种质资源。以40份割手密无性系为试验材料，在苗期低温胁迫后测定各无性系材料的7项生理指标，利用相关性分析、聚类分析和模糊隶属函数分析法对其耐寒性差异进行综合评价。低温胁迫处理后，割手密的脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、电导率（PMP）、可溶性蛋含量（SP）均呈上升趋势，其中脯氨酸含量上升最大，升高了43.81%，而叶绿素（Chl）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）均呈下降趋势，其中叶绿素含量减少35.01%，下降程度最大;叶绿素、脯氨酸、超氧化物歧化酶的变异系数较对照有不同程度的增加，其中增长最大的是叶绿素，是对照的1.76倍;相关性分析显示，40份割手密无性系耐寒性与其生长地的海拔、纬度呈极显著正相关，相关系数分别为0.867、0.686;模糊隶属函数和聚类分析将40份割手密无性系的耐寒性分为三类，其中高耐寒类型有10份材料，中耐寒性有19份，不耐寒性11份。研究结果表明，不同采集地割手密材料之间耐寒性指标存在明显差异;耐寒隶属函数与海拔、纬度呈极显著正相关，即高海拔和高纬度的割手密耐寒性强、低海拔和低纬度的割手密耐寒性弱，表明在相近海拔范围内决定耐寒性的主要因素是纬度，在相近纬度范围内决定耐寒性的主要因素是海拔。该结果为割手密种质资源在甘蔗耐寒育种中的进一步利用提供依据。
　　关键词  割手密;耐寒性;模糊隶属函数法;海拔;纬度中图分类号  S566.1      文献标识码  A
　　Abstract  To screen cold tolerance of wild sugarcane germplasms， and to explore the relationship between cold tolerance with original altitude and latitude， the comprehensive evaluation of cold tolerance of clones of Saccharum spontaneum L. from different habitats were performed. After low temperature stress at seedling stage， seven physiological indexes of 40 S. spontaneum clones samples were evaluated using cluster analysis， fuzzy membership function analysis and correlation analysis. Compared with the control group， the contents of Pro， MDA， PMP and SP in the stressed clones increased， in which the content of Pro was the highest by increasing 43.81%. The contents of Chl， SOD and POD decreased， moreover the content of Chl decreased the greatest by 35.01%. The coefficients of variation of Chl， Pro and SOD increased in different degrees， and the biggest increase was found in Chl， which was 1.76 times of the control. The result of correlation analysis showed that the cold tolerance of the 40 S. spontaneum clones was significantly positively correlated with the altitude and latitude of the habitats by correlation coefficients， which was 0.867 and 0.686， respectively. All the 40 S. spontaneum clones were divided into three categories according to the cold tolerance using fuzzy membership function and cluster analysis， in which 10 clones showed high cold tolerance， 19 clones showed medium cold tolerance and 11 clones were cold sensitive. The results showed that there were significant differences in cold tolerance among S. spontaneum clones collected from different habitats， and the membership function of cold tolerance was positively correlated with altitude and latitude， namely the clones collected from high altitude and high latitude had stronger cold tolerance than that collected from low altitude and low latitude habitats. It indicated that latitude is the main factor for the cold tolerance of S. spontaneum clones collected from the same altitude， and altitude is the main factor for the cold tolerance of S. spontaneum clones collected from the same latitude. This work would provide the scientific basis for the further utilization of S. spontaneum clones in sugarcane cold tolerance breeding. 　　Keywords  Saccharum spontaneum L.; cold tolerance; fuzz membership function; altitude; latitude
　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.003
　　甘蔗（Saccharum officinarum）为禾本科（Gramineae）甘蔗属（Saccharum）植物[1]，是典型的C4作物，对自然条件有一定的要求，特别是对温度要求比较严格，需要适宜的温度才能正常的生长[2]，一般在温度低于20 ℃时，就会对甘蔗的发育及产量造成一定的影响[3]。甘蔗在我国热带和亚热带地区具有广泛的种植面积，种植面积最大的省份是广西，其次是云南[4]。低温寒害对农作物造成的危害及导致的经济损失已引起世界广泛关注，低温寒害也是我国农业生产中最主要的自然灾害之一[5-6]。割手密（Saccharum spontaneum L.）即甘蔗细茎野生种，又名甜根子草、小巴茅，为禾本科（Gramineae）蜀黍族 甘蔗属（Saccharum）多年生草本植物。该种的特征是抗逆能力强、宿根性能好、生长势旺盛、地域适应性广，是拓宽甘蔗抗逆育种遗传基础的重要资源[7-8]。割手密在我国分布范围广，海拔在1～2700 m，遍及多个气候区，是甘蔗属中地理分布最广、类型最丰富的种群[9-11]，以云南割手密群体多样性最为丰富[12]。近年来，国内外对于割手密的抗逆性研究多侧重于其抗旱性方面，对于其耐寒性研究颇少。
　　植物长期生长在低温的环境中，通过形态特征、生理生化的变化，并经历长期的自然选择和协同进化对低温产生了较强的适应性。在低温胁迫下，甘蔗叶片的丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、质膜透性升高[13-15]，而叶绿素（Chl）含量、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性均下降[16-19]，因此上述指标均可作为鉴定割手密耐寒能力较可靠的依据。本研究对40份不同采集地的割手密无性系通过测定低温胁迫条件下生理生化的变化，以抗寒隶属函数为依据，采用综合抗寒性评价的方法进行耐寒性筛选和评价，筛选耐寒性强的种质，同时分析割手密无性系的耐寒性与原生长地纬度、海拔的关系，以期为割手密资源在甘蔗耐寒育种中的进一步利用提供科学依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　从云南农业大学甘蔗研究所资源圃中选取40份割手密无性系，所选材料的海拔跨度在10～2300 m，从中国云南、四川、西藏、贵州，以及尼泊尔、缅甸等地收集来，集中保育在云南农业大学甘蔗资源圃（昆明），具體信息见表1。
　　1.2  方法
　　1.2.1  材料种植与管理  材料种植在云南农业大学甘蔗研究所大棚内，采用盆栽的方法，2017年5月初将40份割手密材料均匀分兜，每个无性系种植6盆，其中3盆作为处理组（低温胁迫），另外3盆作为对照组。每盆加入同样重量的营养土和水，定期田间管理。
　　1.2.2  低温胁迫  参试材料生长至苗期，参照曹哲群等[19]的方法将处理组移至低温光照培养箱内进行低温（3 ℃）胁迫处理，设置光照时间为13 h/d，在处理3 d后对所有供试材料（对照组和处理组）同时取样;剪取+1叶迅速带回实验室进行各项指标测定。
　　1.2.3  生理指标测定  对叶片进行生理生化指标测定：以电导率仪法[20]测定细胞膜透性，硫代巴比妥酸法[21]测定MDA含量，酸性茚三酮法[22]测定游离Pro含量，考马斯亮蓝G-250染色法[23]测定可溶性蛋白含量，氮蓝四唑法[24]测定SOD活性，分光光度法[25]测定Chl含量，愈创木酚法[26]测定POD活性。
　　1.3  数据分析
　　各参试材料的7项生理指标的测定数据整理后用SPSS 17.0软件进行统计和聚类分析[27]。
　　式中A为各材料指标的隶属函数值，Hmin为各材料指标的最小值，Hmax为各材料指标的最大值，B为材料的模糊隶属函数均值，n为指标数，模糊隶属函数值的区间为[0，1];若指标与耐寒性呈正相关，用公式（1）计算模糊隶属函数值，若指标与耐寒性呈负相关，选用公式（2）计算模糊隶属函数值，最后用公式（3）计算模糊隶属函数均值，B值越大，表明该材料耐寒性越强。
　　2  结果与分析
　　2.1  低温胁迫后割手密材料的相关生理指标测定
　　40份割手密无性系各自的7项生理指标的测定结果表明，在低温胁迫下，割手密的Pro、电导率、MDA、可溶性蛋含量均值较对照均有不同程度的升高，其中Pro含量均值上升最大，较对照均值升高了43.81%，其次是MDA、电导率、可溶性蛋含量均值分别较对照升高了34.26%、33.33%、13.07%（表2）。其他指标在低温胁迫下都有不同程度的降低，其中Chl含量均值较对照减少35.01%，下降程度最大;SOD与POD较对照分别下降16.55%、15.63%。可见，不同采集地的割手密在低温胁迫下，对生理指标的影响存在差异，表明他们的耐寒性不同。
　　此外，低温胁迫处理与对照相比，除Chl、Pro、SOD的变异系数有不同程度的增加，其他指标的变异系数有不同程度的降低，其中增长最大的是Chl，比对照增加了0.121，是对照的1.76倍;其次是Pro，比对照增加了0.039，是对照的1.16倍，表明Chl和Pro对低温胁迫最敏感。综上所述，不同采集地40份割手密无性系的耐寒性与多种指标有关。
　　2.2  不同采集地割手密耐寒性综合评定
　　2.2.1  模糊隶属函数  本试验检测的7项指标在评价耐寒性中所起到的作用不同，利用其中任何单一指标来评价割手密耐寒性均有一定的片面性。综合7项耐寒性生理指标，利用模糊隶属函数法计算隶属函数加权平均值，对不同采集地来源40份割手密的耐寒性进行综合评价（表3）， 　　使结果更加有说服力。结果显示，低温胁迫下40份不同采集地来源割手密的耐寒性由强到弱排序依次为：1982-25>1990-2>2012-28>2013-13> 1982-34>1988-283>I1991-10>2013-10>2012-51> 2012-25>82-125>2012-32>1988-277>1982-33>1988-301>2012-31>I1991-118>2012-44>1983-193>1982-132>I1991-7>1984-260>I1991-17>1984-251>2012-45>1982-112>1982-134>1984-261>1983-255>1984-249>1982-106>1988-269>I1991-65>2015-88>1982-127>2015-89>2015-4>2015-6>2015-33>2015-32。
　　2.2.2  聚类分析  对40份不同采集地割手密无性系的隶属函数加权平均值进行排序，系统聚类分析结果表明（图1），供试材料的耐寒性可划分为3种类型，即高度耐寒、中度耐寒和不耐寒，82-25、1990-2、2012-28、2013-13、82-34、1988-283、I91-10、2013-10、2012-51和2012-25共10个材料聚类为高度耐寒材料，占供试材料的25%;82-125、2012-32、88-277、1982-33、1988-301、2012-31、I91-118、2012-44、83-193、82-132、I1991-7、84-260、I91-17、1984-251、2012-45、82-112、82-134、1984-261和83-255共19个材料聚类为中度耐寒材料，占供试材料的47.5%;84-249、82-106、88-269、I91-65、2015-88、82-127、2015-89、2015-4、2015-6、2015-33、2015-32共11个材料聚类为不耐寒材料，占供试材料的27.5%。
　　2.3  割手密耐寒性与其采集地海拔和纬度的关系
　　各无性系的耐寒性与其生长地海拔的关系见图2。表3为40份割手密无性系的耐寒性综合评价表，结合图2可直观看出40份割手密无性系的耐寒性随原生长地海拔高度的增加呈增大的趋势，即高海拔地区生长的割手密耐寒性强、低海拔地区生长的耐寒性弱。整个曲线图出现较大波动是因为在相近的海拔范围内，纬度的高低成为影响割手密的耐寒性的主导因子，如在海拔1280 m的1984-261和海拔1320 m的2013-10兩个割手密材料，虽然海拔相差40 m，但是纬度相差4°13′N，表现出较大的耐寒性差异，所以出现了明显的波动;海拔为300 m的I1991-118这份割手密无性系因来源高纬度，较相近海拔无性系表现出较好的耐寒性，曲线出现明显的波动。表明海拔越高，则耐寒性越强;海拔相近，纬度越高，则耐寒性越强（图2）。
　　各无性系的耐寒性与其生长地纬度的关系见图3。从图3可看出，40份割手密无性系的耐寒性随原生长地纬度的增加没有显示出明显增的加趋势。生长在相近纬度25°01′N的1982-25和25°08′N的1984-261两个无性系，虽然纬度很接近，但海拔相差1064 m，表现出较大的耐寒性差异，曲线出现较大的波动;生长在同一纬度25°01′N，海拔分别为2344 m（1982-25）和1700 m
　　（1988-283）的2个无性系，海拔相差640 m，由于类似情况较多，曲线出现明显的波动，引起的曲线波动还可能与材料的染色体数目、耐寒性相关基因等有关。表明在相同纬度条件下，决定耐寒性强弱的是海拔，即海拔越高，耐寒性越强;海拔越低，耐寒性越弱（图3）。
　　2.4  割手密无性系的耐寒性与海拔和纬度的相关性分析
　　对40份割手密无性系耐寒性与其采集地海
　　拔和纬度的相关性进行分析，结果表明耐寒隶属函数与海拔、纬度呈极显著正相关，相关系数分别为0.867、0.686（表4）。即高海拔、高纬度的
　　0～25的标尺刻度表示类别之间的亲疏距离。
　　材料序号与编号的对应关系见表1。
　　材料序号与编号的对应关系见表1。
　　割手密无性系耐寒性强;低海拔、低纬度的割手密无性系耐寒性弱。
　　3  讨论
　　3.1  甘蔗及其野生资源植物的耐寒性评价指标及方法
　　植物在生长过程中受到环境等诸多因素的影响，其中温度是作物生长发育过程中十分重要的生态因子，甘蔗是喜温作物，不同甘蔗品种对低温的抵抗能力是不同的。在自然降温过程中，甘蔗受到低温胁迫会发生形态及生理生化等方面的变化。Lyons和Raison在研究低温胁迫对植物生理功能影响时发现，植物细胞膜的膜流动性与植物抗寒性密切相关，低温胁迫后细胞膜发生相变，生物膜透性增大导致胞内离子渗漏，电导率增大[28];有研究表明叶片的相对电导率是鉴定作物抗寒性的指标之一[29]。低温在改变叶片质膜透性的同时也导致细胞膜脂过氧化，而丙二醛是膜脂过氧化的产物之一，其含量可反映细胞膜脂过氧化程度及受低温伤害的程度[30]。本研究通过对40份试验材料在苗期进行低温处理，结果表明在低温胁迫后供试材料叶片相对电导率有不同程度的升高，细胞内膜脂过氧化加剧，MDA含量增加，可见低温环境对甘蔗细胞膜系统稳定性有一定程度的破环，而脯氨酸是重要的细胞渗透调节物，在低温胁迫下可以增强细胞的持水力，维持细胞结构、细胞运输和调节渗透压等，使植株表现出一定的抗性，植物会大量积累脯氨酸来抵御各种环境胁迫[31]。本研究对照组中甘蔗叶片脯氨酸含量持较低水平，低温胁迫导致脯氨酸含量有不同程度的增加，且其含量的增加数值比其他耐寒指标的增加数值都高;其均值较对照均值上升43.81%，其中82-25升高幅度最大，90-2次之，说明脯氨酸是甘蔗对寒冷适应的重要生理反应，其含量的增加有利于提高蔗株耐寒性，这与李茂枝等[13]和唐仕云等[15]的报道一致，表明蔗叶内脯氨酸含量可作为衡量甘蔗及其野生资源植物的耐寒性指标之一。 　　低温环境不仅对甘蔗膜细胞系统有影响，对甘蔗叶片叶绿素含量也有一定的影响。有研究报道，叶片叶绿素的稳定指数是鉴定甘蔗耐寒性的指标之一[19]。叶绿素含量是反映植物光合能力的一个重要指标，叶绿体是植物细胞内冷敏感性很强的一个细胞器，低温胁迫会使得植物叶片细胞膜透性增加，并使叶绿素合成受到抑制，还会导致叶绿素的分解加快，叶绿素含量随之降低[31]。通过对40份试验材料在苗期进行低温处理，甘蔗叶片叶绿素含量出现不同程度的下降，变异系数较其他耐寒指标相比叶绿素含量变异系数增长最大，增长0.121，表明叶绿素对低温胁迫最为敏感。综上所述甘蔗叶片相对电导率、丙二醛、脯氨酸、叶绿素含量等都可作为鉴定甘蔗耐寒性的重要指标。本研究由于供试材料是不同生境的割手密无性系，有着非常大的地域性差异，对低温的适应能力各异。因此，在进行甘蔗资源进行抗寒性鉴定时，使用单一的生理生化指标进行评价较为片面，而应以多个耐寒指标进行综合评价。隶属函数法已经应用于甘蔗种质资源抗旱性评价中[27]，同时在其他作物如葡萄[32]、玉米[33]、小麦[34]、苜蓿[35]等作物的抗逆性评价也有成功的应用研究，并证明其对抗性筛选的可靠性。本研究结合前人经验将模糊隶属函数分析法应用于甘蔗耐寒性研究中，综合分析其耐寒性，消除单一指标直接判断带来的误差，使试验结果更加准确、可靠。
　　聚类分析方法在种质资源研究中已广泛应用，黄忠兴等[12]采用聚类分析的方法将国内外割手密资源聚成三大不同类群，各类群在植株生长特性及锤度方面具有极显著差异;周会等[36]在评价甘蔗种质资源自然条件下耐寒性研究中通过系统聚类方法将参试材料分为耐寒性强、耐寒性较强、耐寒性一般、耐寒性較差、耐寒性差等5个耐寒性表现类群。本研究利用聚类分析法将供试材料聚类为高度耐寒材料、中度耐寒材料、不耐寒材料3类，研究结果可为割手密资源在甘蔗抗寒育种中的进一步利用提供依据。
　　3.2  原生地海拔和纬度与割手密耐寒性之间的关系
　　在自然条件下，气温会随海拔、纬度的升高而降低。李绅崇等[37]的研究结果揭示由海拔和纬度引起的温度变化是形成水稻不同的耐寒性生态类群的关键因素;戴献英[38]的研究结果表明割手密的电解质渗漏率随原生长地海拔的上升而下降、随原生长地点纬度增高而降低，即高海拔、高纬度的材料耐寒性较强。
　　本研究对不同采集地来源的40份割手密无性系进行耐寒性评估，低温胁迫下对其七项耐寒性生理指标进行测定，利用相关性分析无性系的耐寒隶属函数均值与海拔纬度的相关关系，结果显示耐寒隶属函数值与海拔、纬度呈极显著正相关，即高海拔、高纬度的割手密耐寒性强，低海拔、低纬度的割手密耐寒性弱。表明在相近海拔范围内决定耐寒性的主要因素是纬度，在相近纬度范围内决定耐寒性的主要因素是海拔。例如海拔为300 m的I1991-118这份割手密无性系使曲线出现较强的波动;生长在相近纬度25°01′N的1982-25和25°08?N的1984-261两个无性系，虽然纬度很接近，但海拔相差1064 m，表现出较大的耐寒性差异，曲线出现较大的波动。因为甘蔗的耐寒性不仅与各无性系生长地的海拔、纬度有关;同时，耐寒性也是多基因控制的数量性状，涉及的基因和代谢众多，对甘蔗耐寒性评估产生一定的影响。
　　4  结论
　　不同采集地40份割手密无性系的耐寒性可聚类为高抗、中抗和不抗3种类型，鉴定出10个高度耐寒材料、19个中度耐寒材料、11个不耐寒材料;对不同割手密无性系的耐寒性与其采集地海拔和纬度的相关性分析结果表明耐寒隶属函数值与海拔、纬度呈极显著正相关，相关系数分别为0.867、0.689;即高海拔、高纬度的割手密耐寒性强，低海拔、低纬度的割手密耐寒性弱;在相近海拔范围内决定耐寒性的主要因素是纬度，在相近纬度范围内决定耐寒性的主要因素是海拔。
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