植物花色苷的研究进展

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　　摘要：植物花色苷是一种广泛存在且可赋予植物组织和器官五彩缤纷色彩的植物色素，具有多种生物活性，在食品、医疗及保健品行业拥有广阔的应用前景。文章结合国内外研究情况综述了花色苷的稳定性、提取分离方法、生物活性及遗传等方面的最新研究成果，指出当前针对植物花色苷的研究主要集中在探索影响植物花色苷稳定性的因素及优化提取工艺等方面，而针对植物花色苷发挥生物活性的机理和产品开发的研究相对不足，以选育富含花色苷的植物新品种为目的的分子标记开发和分子标记辅助育种研究非常有限。提出今后需进一步提升植物花色苷的分离纯化技术，并借助现代生物技术探索植物花色苷发挥生理活性的机制;同时，应加强花色苷植物种质资源的收集、鉴定和遗传多样性分析，构建群体开发植物花色苷合成相关的分子标记，指导富含花色苷的植物新品种选育工作。
　　关键词： 花色苷;稳定性;提取;生物活性;分子标记
　　中图分类号： S311;Q946.83                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0278-08
　　Abstract：Plant anthocyanins，the widespread plant pigments with various bioactivities，have wide application prospects in food industry，medical industry，and health care industry. They can make plant tissues and organs colorful. In the present article，the latest research progresses related to stability，isolation methods，bioactivities and heredity of plant anthocyanins were reviewed. It was found that most previous researches were focused on studies of the factors affecting stability and isolation process improvement of plant anthocyanins. The mechanism study of the bioactivities of plant antho-cyanins and researches on products development lagged behind. Studies on molecular markers development and molecular marker assisted breeding targeting new plant varieties that were rich in anthocyanins were rare. Based on the problems above， more studies need to be focused on the purification technique improvement， and the mechanism studies of plant anthocyanins activities with the help of omics technology. At the same time， collection， identification and genetic diversity of plant anthocyanins germplasm resources should be strengthened. Molecular markers related to plant anthocyanins group development for modern biology should be established to guide the new varieties breeding that are rich in anthocyanins.
　　Key words： plant anthocyanins; stability; isolation; bioactivity; molecular markers
　　0 引言
　　花色苷（Anthocyanins）是廣泛存在于植物的果实、花、叶、茎、根等器官的水溶性植物色素，属于类黄酮类物质，在不同酸碱度或金属离子作用下可呈现红色、紫红色及蓝色，因而可赋予植物组织和器官五彩缤纷的色彩。植物花色苷具有预防多种疾病和生理保健等生物活性，在调节眼健康、代谢紊乱、心血管疾病、抗病原微生物、脑健康、抗炎症及抗癌等方面均可发挥一定作用（Antonella et al.，2016），也是食品工业中利用最广泛的食品添加剂之一。文章结合国内外关于植物花色苷的研究情况，对花色苷的结构性质、提取分离、合成调控、生物活性及其相关分子标记开发等方面的最新研究成果进行综述，以期为花色苷的深入研究提供借鉴。
　　1 植物花色苷的稳定性
　　植物花色苷的化学性质极不稳定。特别是在体外条件下，因此限制了其在食品工业中的应用。花色苷的稳定性受多种因子影响，了解植物花色苷的稳定性，有利于对其开展研究和应用。
　　pH对植物花色苷的影响最大。花色苷在酸性条件下较稳定，当pH大于7.0时花色苷将发生降解，然而酸性过强可能导致糖配体水解（凌文华和郭红辉，2009;孙鹏尧等，2014）。当pH为1.0时，花色苷主要以黄烊离子（Flavylium cation）形式存在，呈现红色或紫色;当pH在2.0～4.0时，花色苷以醌（Quinoidal）的形式存在，呈现蓝色;当pH在5.0～6.0时，花色苷以颜色较浅的甲醇假碱（Carbinol pseudobase）和查尔酮（Chalcone）形式存在;当pH大于7.0时，花色苷逐渐降解（Kennedy and Waterhouse，2000）。在溶液pH为2.0和3.0的条件下，紫马铃薯中的花色苷保持正常结构，溶液颜色为红色;pH在4.0～6.0的条件下，花色苷的基本结构保持率为85%左右，溶液颜色为粉色;pH为7.0的条件下，花色苷的基本结构保持率为80%，溶液颜色为蓝色;pH为8.0时，约50%的花色苷基本结构遭到损害，颜色变为蓝绿色（于文娟，2013）。可见，花色苷的颜色随溶液pH的变化而显著变化，在强酸性条件下呈现红色，弱酸性条件下呈现紫红色，随pH的进一步增大，花色苷将逐渐褪色，而在碱性溶液中花色苷呈现蓝色。 　　温度是影响花色苷稳定性的另一个重要因素。花色苷的一个重要作用是作为食品添加剂使用，而食品在被消费前通常需要经历高温加工过程，因而花色苷的热稳定性对其在食品工业中的利用具有重要影响。随温度的升高，花色苷的稳定性急剧降低。高温条件下花色苷在不同pH条件下的稳定性也不尽相同。Sui等（2014）研究发现，在设定的温度（100～165 ℃）和pH（2.2～6.0）范围内，两种从黑米中分离得到的花色苷的稳定性随pH的升高而降低，在pH 2.2、温度100 ℃的条件下，降解速率常数（Degradation rate constant）最低（8.99×10-4/s），在pH 6.0、温度165 ℃的条件下降解速率常数最高（0.120/s）。高温同样影响紫甘薯花色苷的稳定性，90或100 ℃高温处理可明显降低紫甘薯花色苷的保留率，90和100 ℃处理6 h后，花色苷的保留率分别为71.88%和45.76%（孙鹏尧等，2014）。
　　花色苷可通过与金属离子形成螯合物进而提高其稳定性，在食品工业中有利于维持花色苷的稳定性，特别是当金属离子无毒害作用，甚至是人体所必须的离子时。B环上含有o-di-hydroxyl基团的花色苷（Cy、Dp、Pt）可与金属离子络合。有研究认为花色苷在植物中所呈现的蓝色与花色苷和金属离子形成的复合物有关（Hale et al.，2001）。在喜马拉雅蓝罂粟（Himalayan blue poppy）花瓣细胞中，铁元素与花色苷的比值为0.8，在pH为5.0的缓冲液中混合花色苷、黄酮醇及金属离子，可得到与喜马拉雅蓝罂粟花瓣同样的蓝色，该溶液的可见吸收光谱与喜马拉雅蓝罂粟花瓣相同，且Fe3+、Mg2+和黄酮醇为溶液显示蓝色所必需（Yoshida et al.，2006），说明金属离子对花色苷的稳定性有显著影响。
　　不同植物物种或同一物种的不同品种间所含的花色苷稳定性存在一定差异。不同品种间花色苷稳定性的差异可能与不同品种所含花色苷的种类及花色苷的浓度有关（田密霞等，2015）。黑米、黑大豆和黑玉米种皮的花色苷，在避光、自然光和日光灯条件下稳定性最好的是黑大豆花色苷，其次是黑米花色苷和黑玉米花色苷;而在温度相同条件下，黑米和黑大豆种皮花色苷的稳定性优于黑玉米花色苷（李莉蓉等，2007）。姚蓓等（2017）比较了5个蓝莓品种（巴尔德温、巨蓝、园蓝、灿烂和安娜）中花色苷的稳定性，发现在不同pH、SO2、辅色剂及微波作用下不同品种花色苷的稳定性和色泽变化趋势基本一致，且花色苷只有在酸性条件下才能稳定存在，综合分析认为5个蓝莓品种的花色苷稳定性由强到弱依次为巴尔德温、巨蓝、园蓝、灿烂和安娜。
　　2 植物花色苷的提取分离
　　由于植物花色苷的不稳定性，提取方法不当时很容易导致花色苷在提取分离过程中混入其他物质，甚至发生降解。因此，选择并优化植物花色苷的提取分离方法尤为重要。常用的植物花色苷提取技术主要包括溶剂浸提法、超声波辅助提取法及超临界流体萃取法。
　　2. 1 溶剂浸提法
　　花色苷是水溶性极性黄酮类化合物，在碱性或中性溶液中不稳定，为防止提取过程中花色苷降解，通常会加入一定浓度的酸。通过比较不同溶剂（甲醇、乙醇、水）与酸（醋酸、HCL、柠檬酸、甲酸、丙酸、酒石酸）的组合对从果渣中提取花色苷效率的影响，发现在单独使用情况下甲醇的提取效率最高，分别比仅用乙醇或水作溶剂提取的效率高20%和73%。不同酸和溶剂的组合对花色苷提取效率的影响不同，通常甲醇与柠檬酸的组合可获得较高的花色苷提取效率（Silva et al.，2017）。甲醇具有毒性，对人体的神经系统和血液系统有影响。因此，如果欲将提取的植物花色苷用作食品添加剂，应选用1%盐酸—乙醇溶液。由于不同组织样品的化学成分不同，所以从不同组织样品中提取花色苷时需重新优化提取条件以获得更好的提取效果。从赤霞珠葡萄中分离花色苷时，降低丙酮与水的比率会导致花色苷产量降低;如果以乙醇为溶剂，降低乙醇与水的比率则可提高花色苷产量（Vatai et al.，2009）。溶剂与酸的组合对从不同组织样品中提取花色苷效果的影响可能与不同组织来源的样品其花色苷组成不同有关。尽管酸化的有机溶剂有利于从植物组织细胞中提取花色苷，但过强的酸性可能会导致糖苷键水解，生成花青素和糖配基，甚至会影响后续分离提取步骤的实施。总体来讲，在采用溶剂提取植物花色苷时应注意以下几点：（1）由于植物花色苷为极性分子，因此根据相似相溶的原理，应选取极性溶剂;（2）为防止提取过程中花色苷降解，应在提取溶剂中加入一定量的酸;（3）酸性过强会造成花色苷糖苷键水解，为获得较好的提取效果，可选用柠檬酸或醋酸，提取液的酸度一般保持在pH 2.0～4.0;（4）提取原料与提取液的料液比以1∶10～20（g∶mL）为宜（徐青等，2016）。吉雪慧等（2018）以溶剂提取法从仙人掌果中提取花色苷，采用响应面法对提取温度、提取时间、溶剂体积分数3个因素进行优化，确定在提取温度55 ℃、提取时间70 min、溶剂体积分数51%条件下提取率最高（296.7 mg/100 g），并认为提取温度和提取时间、乙醇体积分数和提取时间对花色苷提取效率的相互作用均不明显，且各因素对仙人掌果中花色苷提取率的影响不呈现简单的线性关系，以最优化提取条件进行仙人掌果花色苷提取得到的实际提取率与预测值很接近，证明了优化方案的可靠性。
　　2. 2 超声波辅助提取法
　　超声波辅助提取法可节约提取成本，缩短提取时间，提高提取效率，从而提升花色苷提取物的产量和质量。超声波的空化作用可使液体产生大量微泡，这些微泡迅速膨大、闭合，使液体微粒间发生剧烈碰撞，进而促使液体温度骤然升高，使溶液发生乳化，加快溶质溶解，进而加速化学反应。朱洪梅（2007）在单因素和正交试验的基础上确定超声波辅助酸化乙醇提取紫甘薯花色苷的最佳提取工艺为料液比1∶10、提取温度70 ℃、提取时间40 min。于文娟（2013）通过单因素试验分别探索了提取溶剂乳酸浓度、提取時间、提取温度及料液比对紫马铃薯花色苷提取的影响，并最终确定适宜的提取工艺为提取溶剂乳酸浓度3.0%、处理时间30 min、处理温度45 ℃、料液比1∶60，此条件下花色苷的提取效率为140.19 mg/100 g，提取液中花色苷的浓度为25.96 mg/L。由此可见，利用超声波辅助技术提取植物花色苷时，所用的组织样品不同，其最佳提取工艺也存在差异。 　　3. 3 抗炎活性
　　炎症是组织细胞应对伤害、刺激的一个复杂响应过程，是细胞因子（Cytokine）、酶、脂质介质（Lipid mediator）和血管活性介质（Vasoactive mediator）等调控的一系列生物学事件。越来越多的研究表明，植物花色苷能改善与炎症相关的结肠炎（Colitis）、喉咽反流（Laryngopharyngeal reflux）、阴茎纤维性海绵体炎（Peyronie disease）、餐后炎症反应（Postprandial inflammatory response）和牙周炎（Periodontal disease）等症状。
　　环氧酶（Cyclooxygenases，COXs）是促发炎症的关键酶，可将花生四烯酸转化为促发炎症的细胞因子前列腺素（Prostaglandins）（Aymoto et al.，2013），因此抑制COXs的活性对于防止炎症的发生至关重要。Aymoto等（2013）以carrageenan（cg）诱发的小鼠足跖肿胀模型和腹膜炎两个急性炎症实验模型研究了野生桑椹提取物和矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside，C3G）的抗炎特性，分别在cg处理前30 min和处理后1 h给小鼠喂食花色苷提取物和C3G，结果显示无论在cg处理前或处理后，花色苷提取物和C3G均能抑制小鼠足跖肿胀;cg处理后1 h喂食花色苷提取物和C3G可降低腹膜渗出物中的多形核白细胞（Polymorphonuclear leukocyte，PMN），在cg处理小鼠前30 min喂食花色苷提取物降低PMN的效率更高;且喂食花色苷提取物和C3G均能抑制COX-2 mRNA水平和蛋白质水平的表达量。NO在血压调控、血管舒张、子宫收缩等一些列生理和病理过程中发挥重要作用，NO缺乏是很多疾病发作的标志，但过量同样会造成诸如头痛、头晕、低血压、炎症等问题。Li等（2014）通过调查花色苷对NO在Lipopolysaccharide（LPS）/IFN-γ-activated RAW264.7巨噬细胞中的抑制作用，研究了植物花色苷的抗炎作用，认为花色苷通过抑制NF-κB、COX-2和MAPKs的活性在体内和体外条件下均可缓解炎症。花色苷混合物、飞燕草-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷均能抑制炎症反应，但花色苷混合物对炎症因子的抑制作用较飞燕草-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷分别单独使用更强（刘彩芬等，2017）。
　　3. 4 防御心血管疾病活性
　　心血管疾病是一种严重威胁人类健康的疾病，与血小板凝聚（Platelet aggregation）、高血压（Hypertension）、高血浆低密度胆固醇（High-plasma LDL cholesterol）和血管内皮障碍（Vascular endothelium dysfunction）有关。流行病学研究结果显示，植物花色苷等抗氧化剂在预防和治疗心血管疾病方面发挥积极作用。Mink等（2007）利用美国农业部的数据库分析了食物中黄酮类物质摄取量与心血管疾病间的关系，结果显示花色苷的摄取量与冠心病（Coronary heart disease，CHD）、心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）及总死亡率呈显著负相关，推测摄取富含植物花色苷、黄酮类物质的食物可降低由冠心病、心血管疾病造成的死亡率。Cassidy等（2013）研究了花色苷摄取与心肌梗塞（Myocardial infarction，MI）的联系，结果表明高花色苷摄取量与罹患心肌梗塞呈负相关，推测高花色苷摄取量可降低罹患心肌梗塞的几率。动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）是常見的心血管疾病。黑米花色苷能通过其抗氧化作用有效延缓动脉粥样硬化的发生和发展，并能改善多个与动脉粥样硬化相关的危险因素（王庆，2007）。植物花色苷对心血管疾病的影响可能与花色苷可增强血清的抗氧化能力、保护低密度胆固醇不被氧化、抗炎及抗血小板凝集有关。
　　4 植物花色苷分子标记开发
　　结合现代生物技术，开展分子标记辅助选择的高花色苷育种可作为未来作物育种的一个方向。植物花色苷相关的QTL（Quantitative traits loci）定位和分子标记开发可促进影响植物花色苷合成的基因定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种（Molecular marker assisted breeding，MAB）的实施。
　　目前，已有植物花色苷相关QTL定位和分子标记开发研究的报道。相对于植物花色苷化学研究和病理学研究，植物花色苷QTL定位和分子标记开发研究依然相对欠缺，当前开展花色苷相关分子标记开发研究较深入的作物是玉米。Qin等（2012）利用黑玉米自交系SDW为共同父本，分别与黄玉米自交系Mo17和白玉米自交系木6杂交构建了两个F2群体，对玉米黑色素和花色苷含量进行QTL分析，共发现17个与色素相关的QTL位点，两个群体检测到的QTL位点数量、分布及对表型的贡献率均表现出高度一致性，该研究成果为玉米分子标记辅助育种及相关基因的克隆打下了基础。
　　茄科植物中的辣椒、茄子和马铃薯均是重要的蔬菜作物，近年来富含花色苷的紫色茄子和紫色马铃薯深受消费者青睐，因此在这些作物中也陆续开展了与花色苷分子标记相关的研究。辣椒叶片、花、未成熟的果实呈现紫色与其组织中花色苷的积累有关，控制这些性状的位点被定位在辣椒10号染色体上，另外两个茄科植物马铃薯和番茄的相应位置同样存在控制花色苷合成的位点，且该位点对辣椒的果实形状和马铃薯块茎形状有影响，因此推断这3种茄科植物在这些位点可能存在直系同源基因（Chaim et al.，2003）。为寻找与茄子皮色或果皮花青素合成相关基因连锁的分子标记，廖毅等（2009）利用混合品系法（Bulked lines analysis，BSA）筛选到一个与茄子紫红、紫黑果色相关的显性标记，将其转化为SCAR分子标记后对136份茄子材料进行验证，发现准确率为90%。Lorenzo等（2012）利用茄子品种间杂交组合305E40×67/3的F2群体构建包含415个分子标记的遗传图谱，并对花色苷含量进行遗传分析，通过与番茄进行共线性分析确定了调控茄子花色苷合成的候选基因。Cui等（2016）对四倍体彩色马铃薯花色苷含量进行QTL定位，利用黑美人×MIN-021杂种F1代分离群体定位了5个控制花青素含量的QTL位点。 　　与果树花色苷分子标记相关的研究也得到陆续展开。早在1998年，已有研究完成了苹果遗传图谱的构建，并对控制苹果果皮花青素合成的基因Rf进行遗传定位（Maliepaard et al.，1998）。何晓薇等（2009）从 Rf 定位的连锁群上所有的SSR标记中筛选到一个与苹果果皮红色性状相关联的SSR分子标记，利用该SSR分子标记对F1代植株进行表型预测准确率达93.3%。桑树是一种具有药用价值和经济价值的木本植物，帅琴（2014）筛选了桑树中与花青素相关的分子标记，从桑树基因组中鉴定出15个参与花青素合成的基因，在距离这些基因70 kb的区域内设计了SSR引物，遗传连锁分析未发现与桑树嫩叶色连锁的分子标记，推测可能与嫩叶颜色容易受生长环境的影响有关。
　　5 展望
　　植物花色苷具有抗氧化性、抗炎、抗癌、抗心血管疾病、抗糖尿病、抗肥胖等诸多生理活性，同时又是一种天然色素，因而在医疗、食品、保健、化妆品等领域应用潜力巨大。当前针对植物花色苷开展的研究主要集中在探索影响花色苷稳定性的因素及提取工艺优化方面，而针对植物花色苷的研究还存在如下问题：（1）与植物花色苷生理活性机理有关的研究和产品开发相对不足。目前对植物花色苷生理活性的研究基本以从植物中提取的总花色苷为基础，然而自然界中存在超过500种的植物花色苷，究竟哪种花色苷发挥了上述活性及发挥这种生物活性的调控通路均不得而知。因此，解决这些问题首先需提高分离纯化植物花色苷的技术，其次需借助现代生物技术，如转录组、蛋白质组、代谢组等揭示植物花色苷发挥生理活性的调节通路。在此基础上分别有针对性地开发具有抗氧化性、抗炎、抗癌、抗心血管疾病、抗糖尿病、抗肥胖等生理活性的产品。（2）以选育富含花色苷植物新品种为目的的分子标记开发和分子标记辅助育种研究非常有限，在我国这一问题的表现尤其明显。因此首先需加强富含花色苷植物种质资源的收集、鉴定、遗传多样性分析工作;然后利用收集的种质资源构建群体开发植物花色苷合成相关的分子标记，利用分子标记对调控植物花色苷合成的基因进行定位和克隆，进而解析所克隆基因在植物花色苷合成过程中的作用。同时，利用开发的分子标记开展分子标记辅助选择育种，加速育种进程，提高育种的针对性和目的性，以便为消费者提供更多的色彩绚丽、健康安全的高花色苷植物新品种。
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　　 （責任编辑 王 晖）
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