柑橘酸腐病拮抗菌的筛选及其对柑橘品质的影响

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　　摘要 [目的]筛选一株柑橘酸腐病拮抗菌，用于柑橘采后酸腐病的防治。[方法]筛选一株对柑橘酸腐病具有高效拮抗作用的生防菌，并研究其对柑橘可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸及挥发性物质含量的影响。[结果]筛选出的拮抗菌株在平板上对白地霉 （Geotrichum candidum Link）的抑菌率为82.58%。当柑橘酸腐病发病率为96.67%时，接种108 CFU/mL生防菌能有效降低柑橘酸腐病发病率至13.89%。经鉴定发现拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliqufaciens subsp.plantarum），其能延缓柑橘贮藏过程中抗坏血酸含量的下降，保持柑橘果实中可溶性固形物和可滴定酸的含量，延缓果实衰老，提高多种香味物质，特别是柠檬烯、月桂烯、沉香醇及奎醛等的含量，同时延缓正己醛和反式-2-己烯醛等挥发性物质的降解，从而有效延长柑橘的贮藏期，保证柑橘贮藏期内良好的果实风味、食品品质和营养价值。[结论]该研究可推动柑橘采后生物保鲜产业的发展。
　　关键词 酸腐病；拮抗菌；解淀粉芽孢杆菌植物亚种；挥发性物质
　　中图分类号 TS205 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）08-0186-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.049
　　Abstract [Objective]To screen out a strain of antagonistic bacillus of citrus sour rot for the prevention and control of citrus sour rot after harvest.[Method]A strain of biocontrol bacteria with highly antagonistic effect on citrus sour rot was screened out，and its effects on the contents of soluble solid，titratable acid，ascorbic acid and volatiles in citrus were studied.[Result]The inhibition rate of screened antagonistic bacillus on Geotrichum candidum Link was 82.58%.The morbidity of sour rot decreased from 96.67% to about 13.98% when the biocontrol bacillus’s innoculation amount was 108 CFU/mL.The antagonistic bacillus was identified as Bacillus amyloliqufaciens subsp.plantarum，which could prolong the decrease of ascorbic acid content，maintain the content of soluble solid and titratabe acid in the storage period，delaying the fruits’ aging，increase the content of multiple flavor compounds，especially limonene，yrcene，linalool and kratos aldehyde，and reduce the degradation of some volatiles that could inhibit the propagation of pathogenic bacteria，such as hexanal，trans2hexenal，and so on.Furthermore，it could effectively prolong the storage period of citrus，and ensure good fruit flavor，food quality and nutritional value during the storage period of citrus.[Conclusion]The research could promote the development of citrus postharvest biological preservation industry.
　　Key words Sour rot；Antagonistic bacteria；Bacillus amyloliqufaciens subsp.plantarum；Volatile substance
　　柑橘采后病害嚴重，青霉病、绿霉病、酸腐病和蒂腐病是其最主要病害，每年因采后病害对柑橘产业造成的损失难以估计[1]。抑霉唑、嘧霉胺、咪鲜胺和咯菌腈等化学杀菌剂是抑制柑橘采后病害的主要手段，近年来因其对人类健康、生态环境的不利影响，许多国家和地区已严格限制使用[2]。
　　生物防治是利用生物自然拮抗性抑制或杀死病原菌的一种方法，具有目标特异性和环境友好型等优点[3]，是近年来相关行业研究的热点。有文献报道植物次级代谢产物或者提取物能够抑制柑橘病原菌的繁殖，比如Hao等[1-2]发现茶皂素仅仅与少量的咪鲜胺或抑霉唑混合就能显著提高杀菌效果，并延长茶皂素在柑橘表面的保存时间，同时也发现茶皂素与Bacillus amyloliquefaciens联合使用能够显著抑制P.digitatm，P.italicum 和 G.candidum的繁殖。Talibi等[4]研究发现C.villosus、C.siliqua 和 H.umbellatum 3种植物的提取物能不同程度抑制G.candidum的繁殖。Faten等[5]建立了柠檬醛与壳聚糖的联合抑制酸腐病菌的方法。Liu等[6]研究了2种酵母菌对酸腐病病原菌的抑制情况，发现C.laurentii能够竞争性抑制酸腐病病原菌的繁殖。 　　化学杀菌剂抑霉唑、咪鲜胺等不能很好抑制酸腐病病菌的繁殖，只有邻苯酚钠能减缓其生长繁殖[7]。Talibi等[4]发现C.villosus等植物提取物能够不同程度抑制酸腐病病原菌的繁殖。然而，植物代谢物提取过程工艺相对复杂、繁琐。笔者以白地霉（Geotrichum candidum Link）为标靶，筛选高效拮抗菌，研究其对柑橘中可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸及挥发性物质含量的影响，以期推动柑橘采后生物保鲜产业的发展。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　拮抗菌分离样采集于福建省三明市大田县老树林土壤，担子菌纲伞菌红菇科食用真菌根部；柑橘和马铃薯购买于当地农贸市场。
　　枯草芽孢杆菌菌株B1、B2、B3、B4和B5分别购买于武汉某公司、江西某公司、浙江某公司、北京某公司和山东某公司；枯草芽孢杆菌R31、白地霉（Geotrichum candidum Link）为实验室保存菌种。
　　马铃薯琼脂培养基 （PDA）：葡萄糖 20 g，去皮马铃薯 200 g，琼脂粉 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。
　　1.2 试剂 2，6-二氯酚靛酚、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖等试剂均购自天津市百世化工有限公司；C5～C20正构烷烃及环已酮标准品（色谱级）购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
　　1.3 仪器 7890/5973气相色谱-单四极杆质谱仪，为美国Agilent公司产品；Combi PAL气相色谱多功能自动进样器，为瑞士CTC公司产品； DB-5MS石英毛细管柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）；DVB/CAR/PDMS 50/30 μm （二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）萃取头购自美国Supelco 公司。
　　1.4 方法
　　1.4.1 拮抗菌株的筛选及处理浓度。
　　将食用真菌根部及土壤样品各研磨成粉，混合均匀。从混合均匀的2个样品中各称取5.00 g食用真菌根部及土壤混合粉样置于玻珠瓶中，使用振荡器振荡均匀，采用梯度稀释法适当稀释后涂布于PDA培养基，每天观察并挑选长势良好、对周边菌具明显拮抗作用的菌落于PDA培养基培养，并进行纯化。
　　1.4.1.1 拮抗菌株的筛选。
　　无菌条件下从培养7 d的白地霉PDA 培养基中打取菌饼（直径 5 mm），菌丝面向下接种于已经凝固的PDA 培养基中心点，以中心点为轴，绘制X、Y轴。然后，将培养于PDA培养基上12 h的待筛选菌株、标准菌株，以同样方式取出菌饼（直径 5 mm），并将菌饼沿X、Y轴等距离接种于已接种白地霉的PDA培养基中并封口，于28 ℃培养7 d后利用十字交叉法测定白地霉菌落直径。菌株抑菌率按照以下公式计算：
　　抑菌率=[（对照平板中菌落直径-处理平板中菌落直径）/对照平板菌落直径]×100%（1）
　　1.4.1.2 效果验证及浓度筛选。
　　将已筛选出的高效拮抗菌于三角瓶中活化培养12 h，用血球板测量菌体浓度，将菌体浓度稀释成105、106、107、108和109 CFU/mL，待用。将培养基中培养了7 d的白地霉用无菌水配制成菌悬液，控制浓度为1×107 孢子数/mL。
　　将柑橘果实洗净，然后用200 mg/L次氯酸钠浸泡1 min，去除表面各种杂菌，并于通风处晾干。用灭菌金属针沿赤道部位刺孔1个（直径5 mm、深2 mm），然后分别用移液枪移入不同浓度的拮抗菌各15 μL，自然晾干。然后，将晾干后的果实每孔再移入白地霉菌悬液15 μL，自然晾干。
　　最后，用聚乙烯袋（0.03 mm）进行单果包装，每个处理设3次重复，每个重复60个果。置于室温（25±2）℃下，在相对湿度85%～95%条件下贮藏，定期观察损伤接种果实酸腐病的发病情况，5 d后统计发病率。發病率根据以下公式计算：
　　发病率= （发病果数/检查总果数）×100%（2）
　　1.4.2 拮抗菌传代稳定性试验。
　　对已筛选出的高效拮抗菌株的第2、4、6、8及10代菌分别进行对白地霉（Geotrichum candidum Link）的抑菌实验，试验方法与“1.4.1.1”相同。
　　1.4.3 菌株分子生物学及生理生化鉴定。菌种分子生物学和生理生化鉴定均委托中国工业微生物菌种保藏中心完成。
　　1.4.4 拮抗菌株对柑橘品质的影响。
　　三角瓶中活化培养筛选出的拮抗菌12 h，用血球板测量菌体浓度，将菌体浓度稀释成108 CFU/mL，待用。将柑橘果实洗净，用200 mg/L次氯酸钠浸泡1 min，去除表面各种杂菌，通风处晾干。然后将晾干后的果实分别于无菌水、108 CFU/mL菌液中浸泡1 min，自然晾干。再用聚乙烯袋（0.03 mm）进行单果包装，每个处理120个果。置于室温（25±2）℃，相对湿度85%～95%条件下贮藏，定期取样测定。
　　1.4.4.1 可溶性固形物及可滴定酸的测定。
　　可溶性固形物的测定参考国标GB/T 12295—1990[8]，具体如下：准确称取250 g柑橘果肉于水果捣碎机混合均匀，用2层纱布过滤得到滤液。在20 ℃恒温水浴下，以蒸馏水为空白，使用折射仪测定可溶性固形物浓度，每个样品重复3次。
　　可滴定酸的测定方法：准确称取果肉10.0 g，研磨匀浆后，用约60 mL蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，放在沸水浴中浸提30 min。冷却定容至刻度，充分摇匀后过滤至100 mL锥形瓶中。量取20 mL滤液置于三角瓶中，加入2滴1%酚酞指示剂，用已标定的氢氧化钠溶液进行滴定。滴定至溶液初显粉色并在30 s内不褪色时为终点，记录氢氧化钠滴定液的用量，重复3次。以蒸馏水作为空白对照。 　　1.4.4.2 抗坏血酸含量的测定。
　　抗坏血酸含量的测定参考Dewhirst等[9]的方法，略做修改。称取 10.0 g果肉样品，加少量 2%草酸溶液在冰浴条件下研磨成浆状，转入到100 mL棕色容量瓶中，再用 2%草酸溶液定容至刻度摇匀，并于黑暗处静置30 min提取，过滤，收集滤液于棕色瓶。准确吸取10 mL滤液，用已标定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红色，且15 s不褪色为止，记下用量，重复3次。同时，以10 mL 2%草酸溶液做空白滴定。按以下公式计算抗坏血酸含量：
　　W=V×（V1-V0）×ρVS×m×1 000（3）
　　式中，W表示抗坏血酸含量（mg/kg）；V0为空白滴定消耗的染料的体积（mL）；V1为样品液滴定消耗的染料的体积（mL）；ρ为1 mL染料溶液相当于抗坏血酸的质量（mg/mL）；VS为测定时所用样品溶液体积（mL）；V为样品提取液总体积（mL）；m为样品质量（g）。
　　1.4.4.3 柑橘果肉中挥发性物质的测定。分别取新鲜、正常贮存的、拮抗菌菌液处理后储藏的柑橘果肉样品5.00 g置于20 mL螺口样品瓶中，加入3.00 g NaCl，准确加入2 μL环己酮 （0.947 89 μg/mL），作为内标物，旋紧瓶盖。顶空固相微萃取条件：40 ℃平衡20 min；顶空吸附35 min；解吸5 min。
　　色谱和质谱条件：載气为氦气，l mL/min；进样口温度250 ℃，不分流进样；以35 ℃为程序性升温起示温度，在此温度下维持5 min，然后以3 ℃/min升至180 ℃保持2min，最后以5 ℃/min的升温速度升至240 ℃，保持2 min。传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；离子化方式电子电离源 （electronionization，EI），电子能量70 eV，质量范围m/z 35～400。
　　在相同的色谱及质谱条件下，以C5～C20的正构烷烃作为标准，以其保留时间的不同计算样品测试中的化合物的保留指数（retention indices，RI），结合图谱库（NIST2008和Havour2.0）检索结果，同时与文献中已有相应保留值相比来完成挥发性物质的定性。以环己酮为内标，对挥发性物质进行半定量分析，并将影响因子视为1。所有样品重复3次，结果均以平均值±标准差表示。
　　Cx=AxAs×Cs×Vs（4）
　　式中，Cx表示未知挥发性组分的浓度（μg/mL）：Ax表示未知挥发性组分的色谱峰面积；As表示内标的色谱峰面积；Cs表示内标浓度（mg/mL）；Vs表示内标溶液的体积（μL）。
　　1.4.5 数据处理。
　　使用方差分析（ANOVA）对不同样品进行显著性分析（P<0.05），所有统计分析及数据可视化均使用SPPS 17.0和Origin8.50软件进行。
　　2 结果与分析
　　2.1 拮抗菌的筛选
　　通过初筛及与标准菌株的对比，共筛选出4株对白地霉具有高抑制率的菌株，分别命名为HF-1、HF-2、HF-3和HF-4。由表1可知，HF-3菌株对白地霉的抑菌作用最强，抑菌率为82.58%，高于从其他公司购买的标准菌株及实验室自存的菌株。
　　从图1可知，随着HF-3浓度的增加，HF-3对果实酸腐病的抑制作用逐渐增强。当HF-3浓度达到108 CFU/mL时酸腐病发病率降低到13.89%，空白发病率为96.67%。当HF-3浓度升至109 CFU/mL时，对酸腐病的抑制效果没有显著增加，可能与拮抗菌过度消耗果实表面营养从而降低了果实本身的抗性有关。酸腐病是柑橘采后最难防控的病害，当空白组5 d损伤接种发病率为96.67%，拮抗菌HF-3能有效作用于酸腐病菌，降低病害的发生率，表明拮抗菌HF-3对酸腐病有较好的拮抗作用，108 CFU/mL是最适作用浓度。
　　2.2 拮抗菌的性能稳定性
　　拮抗菌产业化过程中最大的问题是稳定性问题。由图2可知，HF-3菌株的第2、4、6、8及10传代菌对白地霉的抑菌率都超过80%，表明HF-3菌株对白地霉的抑菌性能是稳定的，并未因传代次数的增多而降低对白地霉的抑菌效果。
　　2.3 拮抗菌的鉴定
　　经鉴定，HF-3为革兰氏阳性菌，菌体成杆状，中生或端生椭圆形芽孢，饱囊不肿大，菌落乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐，直径约1 mm（图3）。HF-3的生理生化分析结果如表2所示，对照伯杰氏细菌鉴定手册，初步判断HF-3为解淀粉芽孢杆菌植物亚种。
　　分别扩增HF-3的16S rDNA及gyr基因，纯化测序后并采用邻接法 （MEGA 5.0）进行1 000次的相似度重复计算，构建系统发育树。16S rDNA基因进化树显示，HF-3属于枯草芽孢杆菌群，而gyr基因进化树显示HF-3基因序列与甲基型营养芽孢杆菌（Bacillus metylotrophicus）和解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliqufaciens subsp.plantarum）相似度最高，达98%以上。因此确定HF-3菌株为解淀粉芽孢杆菌植物亚种 （Bacillus amyloliqufaciens subsp.plantarum），最终菌株命名为ZFH-3。
　　2.4 HF-3菌液处理对柑橘可溶性固形物及可滴定酸的影响
　　可溶性固形物和可滴定酸是评价柑橘品质的重要指标，同时可溶性固形物与可滴定酸的比值常作为柑橘成熟度的评价指标。从图4可看出，在柑橘采摘5 d内，由于营养物质被切断等原因，可溶性固形物含量急剧下降，同时可滴定酸含量略微上升；后期随着内源乙烯的积累合成（乙烯合成系统 Ⅱ），使柑橘中纤维素、淀粉等大分子物质足渐分解为可溶性小分子。与HF-3L （菌液处理后储藏）和CKL （正常储藏）相比，HF-3菌液能够促成柑橘贮存过程中可溶性糖分的积累，贮存20 d后HF-3L可溶性糖约比CKL高8%。CKL果中可滴定酸在10 d后没有发生显著变化，而HF-3L中可滴定酸在10 d后会逐渐上升，20 d达到最高。同时，HF-3L与CKL相比能有效延缓果实的衰老，这种作用在后期更加明显。这可能是因为HF-3菌株能够在柑橘表面形成一层由多糖-蛋白质化合物-细菌组成，并带有负电荷的生物膜[2]，另外HF-3的呼吸作用能够增加CO2的浓度，一定程度上抑制柑橘自身的呼吸作用，减少可溶性糖的损失；抑制乙烯的产生和降低果胶酶的活性，从而延缓柑橘的成熟和果实软化[10]。 　　2.5 HF-3菌液处理对柑橘抗坏血酸含量的影响
　　由图5可知，在自然贮存中柑橘的抗坏血酸含量呈现先急剧下降后略微上升再降低的过程，与西柚贮存中抗坏血酸含量的变化趋势相同[11]。与正常贮藏柑橘（CKL）相比，贮藏前期HF-3菌液能延缓抗坏血酸含量的下降，贮藏中后期能较好地保持抗坏血酸在果实中的含量，第20、25天抗坏血酸含量分别为CKL样品中的2.5倍和1.9倍。
　　2.6 HF-3菌液处理对柑橘挥发性物质含量的影响
　　应用HS-SPME-GC/MS联用技术分析了新鲜柑橘 （XXL）、HF-3菌液处理柑橘 （HF-3L）及对照柑橘 （CKL）果肉的挥发性物质。通过图谱库检索与RI值比对，结合相关文献，得出香气成分及其定量值。结果表明，在3种柑橘果肉中共检出53种香气成分，其中23种为共有成分，31种为非共有成分，并且各有5～8种相对含量较低的独特成分。HF-3L柑橘样品中香气含量最多，共检出39种挥发性物质，总含量为223.90 μg/g，其次为CKL样品果肉，检出38种，挥发性物质总含量为184.39 μg/g；XXL果肉中共为检出35种挥发性物质，总含量为117.72 μg/g。检出的挥发性物质主要包括萜烯、醛类、酯类、醇类、酚类等；CKL中萜烯类、酯类、酮类含量较XXL增加，醛类、醇类、其他等含量则减少。与XXL相比，HF-3L柑橘中酮类减少，其他类型成分显著上升。柑橘果肉中主要挥发性物质及其风味描述见表3。
　　进一步对3种样品中的挥发性物质进行了主成分分析（图6）。从图6可看出，PCA1和PCA2分别能解释3种样品中挥发性物质差异的56.88%和43.12%，结合PCA1和PCA2能完全解释3种样品中挥发性物质的差异。结果显示，3种柑橘样品中挥发性物质的含量存在显著差异，α-萜品烯、邻苯二甲酸二乙酯、4-萜烯醇、乙烯胺、反式二烯酸等挥发性物质 （F1～F13）主要存在于XXL样品中，柠檬烯、奎酸、壬醛、正辛醛、苯甲醛等多种挥发性物质 （F14～F41）主要存在于HF-3L样品中，α-蒎烯、沉香醇等挥发性物质 （F42～F53）主要存在于CKL中。通过HF-3菌液处理，显著提高了正辛醇、紫苏醇、沉香醇、月桂烯、柠檬烯、γ-萜品烯、苯乙酮、壬醛、ρ-伞花烃和奎醛等香味物质含量，同时减缓了正己醛、反式二烯醛，1-辛醇等香味物质损耗。通过与OAV值相比较，表明沉香醇、月桂烯、柠檬烯、奎醛是柑橘香气成分中最主要的贡献者，使柑橘产生令人愉快的气味。其中沉香醇仅仅在HF-3L样品中检测到，其相对含量为OAV值的540倍，能够产生令人愉悦的花香[12]。柠檬烯、正己醛和反式-二烯醛等挥发性物质不仅是柑橘独特香味的贡献者，而且抑制病原菌的生长[13]。HF-3菌液处理后，柑橘中香茅醇、α-蒎烯和α-萜品烯等香味物质的含量略微降低，但其本身香味贡献度较低。
　　3 结论
　　该研究以白地霉为靶标，从土壤及食用菌根际组织中进行拮抗菌的筛选，筛选出一株对白地霉具高拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliqufaciens subsp.plantarum）。结果表明，当拮抗菌浓度达到108 CFU/mL，能有效的降低柑橘果实酸腐病发病率，控制酸腐病发病率为13.89%；延缓柑橘贮藏过程中抗坏血酸含量的下降，显著提高正辛醇、紫苏醇、沉香醇、月桂烯、柠檬烯、γ-萜品烯、苯乙酮、壬醛、ρ-傘花烃和奎醛等香味物质含量，同时减缓正己醛、反式二烯醛、1-辛醇等香味物质损耗；保持柑橘果实中可溶性固形物、可滴定酸的含量，从而有效延长柑橘的贮藏期，保证柑橘贮藏期内良好的果实风味、食品品质和营养价值。
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