‘云香’水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析

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　　摘  要  本研究利用RT-PCR技術从‘云香’水仙的根中克隆得到了NtNAC1基因，并通过qRT-PCR技术分析了该基因的时空表达模式以及在逆境和逆境相关激素处理下的表达变化，结合分析过表达该基因的转基因烟草植株的表现等解析了该基因的功能。结果显示：NtNAC1基因全长1083 bp，其ORF为918 bp，编码306个氨基酸，N端含有NAM保守结构域，聚分在SNAC1亚组，与香蕉MusaSNAC1、小麦TaNAC47亲缘关系较近。实时荧光定量分析显示，NtNAC1的表达水平随花器官花瓣和副冠的发育呈先上升后下降趋势，始花期达到峰值;NtNAC1在根和叶中高表达，受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG诱导上调，推测该基因可能参与‘云香’水仙花器官的形态建成及响应非生物胁迫。进一步构建表达载体转化烟草，获得9株转基因植株。在高盐和干旱胁迫处理下，转基因植株根系发达、长势更好、存活率高，表明水仙NtNAC1过表达能提高烟草对高盐、干旱的耐受性，在抗逆中起正向调控作用，可作为提高水仙抗性的优良遗传基因资源。
　　关键词  ‘云香’水仙;NAC转录因子;非生物胁迫;功能分析
　　中图分类号  S682.2+1      文献标识码  A
　　Abstract  NtNAC1 was cloned by RT-PCR from the roots of Narcissus tazetta ‘Yunxiang’. The gene was further characterized by analyzing its tempo-spacial expression patterns in N. tazetta ‘Yunxiang’ plants， as well as changes in its expression in the leaves and roots under different stresses and stress-related hormones， and by analyzing the NtNAC1 over-expressing transgenic tobacco plants. The results showed that the cloned full-length cDNA was 1083 bp long， containing an ORF of 918 bp long which would putatively encode a peptide of 306 amino acid residues. The deduced protein possessed a highly conserved DNA binding domain， NAM， at its N-terminal， and was grouped， together with its most closely related proteins， MusaSNAC1 and TaNAC47， into the SNAC1 subgroup on the phylogenetic tree. Quantitative real-time PCR results showed that the expression level of NtNAC1 in petals and coronas first increased and then decreased as the floral organs developed， and reached a peak in the early flowering period. NtNAC1 was abundantly expressed in roots and leaves， and was induced by the treatments of ABA， MeJA， SA， H2O2， NaCl and PEG， indicating that it may be involved in the morphogenesis of floral organs in addition to its principal role in the responses of plants to abiotic stresses. Nine transgenic tobacco lines carrying NtNAC1 were obtained by agrobacterium-mediated transformation and three of them were over-expressing lines. The NtNAC1 over-expressing lines showed better developed root systems and higher survival rates under the treatments of high concentrations of salt and mannitol， as compared with the non-transgenic plants. Our results showed that expressing NtNAC1 increased stress tolerance of plants and its potential in the improvement of abiotic stress resistance of N. tazetta could be further exploited.
　　Keywords  Narcissus tazetta‘Yunxiang’; NAC transcription factor; abiotic stress; functional analysis 　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.012
　　植物经常遭受干旱、高盐等非生物胁迫，对其生长发育造成负面影响。通过分子育种方法来改善植物的胁迫耐受性很有意义[1]。作为植物中最大的转录因子家族之一的NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）转录因子除参与植物生长发育外，还在抵御生物和非生物胁迫中发挥重要作用[2]，并已用于基因工程来改善植物的胁迫耐受性[3]，如，水稻OsNAC14响应ABA、干旱、高盐和低温胁迫，过表达植株穗数多、灌浆率高，表现出优于野生型的抗旱性[4];大豆GmNAC085转入拟南芥，干旱胁迫下过表达植株蒸腾速率降低，生长迟缓，增强了对干旱的耐受性[5];陆地棉GhSNAC3受高盐、干旱和ABA处理诱导表达，过表达该基因的转基因烟草在逆境胁迫下初生根伸长、鲜重增加，抗旱性和耐盐性提高[6];菊花DgNAC1在ABA、盐、干旱、低温处理下上调表达，过表达该基因的转基因菊花的叶水势、相对含水量升高，具有更高的抗旱性和耐盐性[7];碱蓬S1NAC8通过调节胁迫响应基因的表达，增强转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性[8];多毛番茄ShNAC1受PEG、4 ℃和盐胁迫上调，但过表达ShNAC1负调控转基因植株的抗寒/旱和耐盐能力[9];御谷PgNAC21在ABA和盐胁迫下诱导表达，在拟南芥中过表达该基因使GSTF6、COR47、RD20等胁迫应答基因的表达量上调，促进转基因植株种子萌发、根系伸长，提高植株对盐胁迫的耐受性[10]。但目前对中国水仙NAC转录因子在逆境胁迫下的调节作用知之甚少。
　　中国水仙为冬季主要观赏花卉之一，但其产量和品质在很大程度上受外界环境因子影响。这是因为其鳞茎肥大，且根为肉质根，生长发育期间对水分要求高。水仙需要在夏季打破休眠萌芽，全球气温变暖和旱季延长会导致水仙休眠期延长、萌芽期推迟、全生育期缩短、发育不良、产品质量下降等后果，这种影响在水仙主产地漳州日益显现。因此，提高水仙对胁迫的耐受性，培育抗逆水仙新品种有着现实需求。
　　李梦思等[11]從‘云香’水仙中克隆了NtNAC3153，表达分析发现NtNAC3153在ABA、高盐和50 ℃胁迫下能被诱导，故该基因可能和其他作物的同类基因一样参与抗逆调控。本研究以抗性强的水仙新品种‘云香’为研究材料，克隆获得1条NAC基因NtNAC1，分析了其在组织及逆境胁迫下的表达，现将结果报道如下。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　供试材料为多花水仙新品种‘云香’。2017年10月初选取三年生种球置于4 ℃低温下处理1个月，之后进行外源激素和非生物胁迫处理：0.1 mmol/L脱落酸（ABA）、0.1 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、2 mmol/L水杨酸（SA）、10 mmol/L过氧化氢（H2O2）、250 mmol/L氯化钠（NaCl）和20%聚乙二醇（PEG6000），以未经处理（0 h）为对照，处理期间分别采集根和叶。常温下水培种球至开花，期间分别采集根、叶、鳞茎等组织部位，以及花器官整个发育时期的花瓣和副冠。具体处理过程和取样方式参照温秀萍等[12]的方法。所采样品用EZNA Plant RNA Kit（OMEGA）试剂盒提取样品总RNA，电泳检测选取完整的RNA经反转录试剂盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）合成cDNA，无酶水稀释至工作浓度10 μmol/L，?20 ℃保存，用于后续PCR试验。
　　1.2  方法
　　1.2.1  NtNAC1基因的全长cDNA的克隆与分析  从‘云香’水仙转录组中查找NAC基因，选取ORF完整且差异表达的序列，经Blastp比对分析选取1条可能与抗性相关的基因进行研究。Primer 6.0设计引物NtNAC1-F：5-CAAGAATGAGGGCTGAAGTT-3和NtNAC1-R：5′-GAAGAAGAATGGGAAGAAGGAC-3′，以根尖cDNA为模板，用TaKaRa Ex Taq进行基因RT-PCR扩增，具体扩增体系和反应程序参照试剂盒参数，退火温度为58 ℃。扩增产物经1%琼脂糖电泳检测，凝胶成像仪观测割取目的条带，EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA）试剂盒胶回收纯化，连接pMD18-T（TaKaRa）转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，过夜培养挑取单菌落，菌液PCR鉴定后送测序。
　　为预测NtNAC1蛋白的生物学功能，利用在线工具Protparam、TMHMM、SignalP、Netphos等分别分析氨基酸理化性质、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点;利用SOPM、Swiss-model预测蛋白二、三级结构;利用Blastp进行同源蛋白基因的检索，MEGA 6.0邻近法构建系统进化树。
　　1.2.2  NtNAC1基因的表达分析  设计qRT-PCR引物NtNAC1-YG-F：5′-GGTTGGATGATTGGGTTCTC-3′和NtNAC1-YG-R：5′-CGTGTCCTCGTTTGCTTCTA-3′，内参同前人研究[13]，引物为Actin-F：5′-TGCCCAGAAGTGCTATTCCAG-3′和Actin-R：5′-GTTGACCCACCACTAAGAACAATG-3′。扩增体系参照SYBR? Premix Ex Taq?（TaKaRa）试剂盒参数选用25 μL体系，反应程序：预变性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，39个循环数。65～95 ℃每隔0.5 ℃分析溶解曲线，检测引物的专一性。每个处理均重复3次，采用2???Ct法计算相对表达量。
　　1.2.3  NtNAC1表达载体构建  根据载体构建酶切原则，选用Spe Ⅰ和Asc Ⅰ（NEB）在37 ℃下双酶切载体pMDC140，电泳检测回收大片段线性化载体。同时采用In-Fusion克隆技术，设计含酶切位点的引物NtNAC1-V-F：5′-CGACTCTAGAA CT AGTCAAGAATGAGGG CTGAAGTT-3′（Spe I）和NtNAC1-V-R：5′-TAGA GTCGAGGCGCGC CG AAGAAGAATGGGAAGA AGGAC-3′（Asc I）扩增目的基因，产物回收纯化，通过5X In-Fusion HD Enzyme Premix连接得到2× 35S ：： NtNAC1-G US融合载体。 　　1.2.4  烟草的遗传转化及分子检测  以无菌组培苗龄5周的烟草叶片为材料，切成1～2 cm2的叶盘预培养3 d后，将2×35S ：： NtNAC1-GUS植物表达载体通过冻融法转化到农杆菌GV1301菌株中，28 ℃下培养液体菌液OD600值为0.4～0.6，4000 r/min离心15 min收集菌体，再以含100 mmol/L AS（乙酰丁香酮）的MS液体培养基重悬菌体，室温静置5 h后，叶盘法[14]转化烟草。通过含有潮霉素（Hyg）的MS培养基筛选愈伤组织、抗性芽至获得抗性植株，以TransDirect Plant Tissue PCR Kit（TRAN）试剂盒提取DNA，用于PCR鉴定，同时GUS组织化学法染色幼嫩叶片观察显色结果，于显微镜下拍照。
　　1.2.5  NtNAC1转基因烟草抗旱性和耐盐性鉴定  筛选饱满的T1代种子，消毒后置于含有Hyg的1/2 MS培养基室温培养，同时将野生型种子置于1/2 MS平板培养至种子萌发，一部分幼苗分别转移到含有10 μmol/L ABA、150 mmol/L NaCl、150 mmol/L甘露醇的1/2 MS平板垂直培养，以1/2 MS平板为对照，培养7 d后测量根长。另一部分幼苗移栽花盆营养土（泥炭土∶蛭石=3∶1）培养，3～4叶期时分别进行不同胁迫处理，以野生型植株做对照。室温条件下连续干旱胁迫处理15 d，观测植株长势。高盐处理之前需控制土壤水分，防止土壤水分过大稀释盐溶液，影响胁迫效果，控水10 d后，以400 mmol/L NaCl连续胁迫处理15 d，每3 d浇灌150 mL，观测植株表型。
　　1.3  数据分析
　　所有实验均进行3次技术及生物学重复。采用SPSS 20软件统计数据，进行单因素方差分析不同胁迫随处理时间变化的差异显著性（P<0.05），并使用Sigmaplot 12软件作图。
　　2  結果与分析
　　2.1  NtNAC1基因cDNA全长的克隆与分析
　　采用RT-PCR克隆方法，扩增得到1条长度为1083 bp的目的条带，命名为NtNAC1（GenBank：MG755187.1）。NtNAC1基因的ORF为918 bp，编码306个氨基酸，组成蛋白分子式C1579H2395N439O484S12，分子量为35.7 ku，等电点为5.83，其中带负电的氨基酸（Asp+Glu）43个，带正电的氨基酸（Arg+Lys）39个，不稳定系数为54.53，脂肪系数为52.91，亲水性总平均系数为?0.995，推测其属于酸性、亲水性、不稳定型蛋白。NtNAC1蛋白没有检测到跨膜区域和信号肽，且亚细胞定位预测位于细胞核，推测该蛋白为非分泌型蛋白和核蛋白。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化修饰位点分别有19、9、4个，该蛋白以丝氨酸修饰为主导，可能参与信号转导、生长发育等生理过程。蛋白二级结构元件主要由58.50%无规则卷曲、24.18%α-螺旋、14.05%延伸链、3.27%-转角结构组成;蛋白三级结构同源建模参考与抗性相关的水稻SNAC1蛋白，结构相似性达84.62%，推测NtNAC1具有相似功能，参与抗逆性调控。
　　2.2  NtNAC1蛋白同源比对及进化树分析
　　利用NCBI搜索NtNAC1蛋白同源序列进行多序列比对，分析发现与单叶植物石刁柏（Asparagus officinalis）、番红花（Crocus sativus）和双子叶植物睡莲（Nelumbo nucifera）、博落回（Macleaya cordata）相似性分别为79%、69%、65%、63%，而与同一品种‘云香’NtNAC3153蛋白序列一致性仅为31.05%。NtNAC1蛋白氨基端同源性高，第15～141位氨基酸残基组成NAM结构域，包含A～E等5个子域，其中子域A、C、D相较B、E同源性高，C子域含有核定位信号（NLS：PRDRKYP），而羧基端同源性低，由此认为NtNAC1是NAC转录因子家族新成员。选取已知具有抗逆胁迫功能的水稻、拟南芥、小麦等不同植物的NAC氨基酸序列构建系统进化树聚类分析，NtNAC1主要聚集SNAC1亚组，与香蕉MusaSNAC1和小麦TaNAC47亲缘关系较近。
　　2.3  NtNAC1基因组织表达分析
　　‘云香’水仙NtNAC1基因在各个器官、组织以及不同的花发育时期中均有表达，在根中优势表达，为鳞茎的31.32倍。花瓣和副冠中NtNAC1表达量在花蕾期没有发生显著变化，
　　之后该基因的表达量随花器官发育呈先上升后下降趋势，始花期副冠中NtNAC1的表达量达到峰值，为花苞期的2.68倍，盛花期花瓣中NtNAC1的表达量到达峰值，为花苞期的4.52倍。同一发育时期，除花蕾期花瓣中NtNAC1的表达量稍微低于副冠，其余时期高于副冠，
　　2.4  NtNAC1在非生物胁迫下表达分析
　　通过qRT-PCR技术分析NtNAC1基因在外源激素ABA、MeJA、SA和H2O2、NaCl、PEG非生物胁迫处理下的表达模式。结果显示，同一处理时间点根中NtNAC1上调表达量大于叶片，具有组织表达特异性;同一组织中NtNAC1的表达量随处理时间的延长不同程度上调，且差异显著。外源激素ABA和MeJA诱导下，叶和根中NtNAC1的表达水平上调8～16倍，SA诱导上调表达量相对较低在4倍以下。H2O2胁迫下，NtNAC1的表达量在叶片先下降后上升，24 h时达到峰值，为对照的5.72倍;根中的表达量与叶片相反，先上升后下降至对照水平，而后急剧上升12 h时达到峰值，为对照的7.57倍。NaCl和PEG胁迫下，叶和根中NtNAC1的表达量上调20倍以上，均呈现先上升后下降的趋势，叶片NaCl胁迫12 h时出现峰值为对照的23.79倍，而PEG胁迫峰值出现较晚，24 h时出现峰值为对照的28.80倍;根中NaCl和PEG表达量均在6 h时达到峰值，分别为对照的42.88倍、34.61倍。结果表明‘云香’水仙NtNAC1基因能被ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG等非生物逆境胁迫诱导表达。 　　2.5  NtNAC1转基因烟草的分子鉴定
　　随机选择12株抗性植株，稀释其DNA至同一浓度，PCR扩增1～9号泳道出现约1000 bp特异性条带，与重组质粒长度一致，获得9株阳性株系。GUS染色显示，阳性株系呈现蓝色且维管束部分颜色较深。以上结果均表明‘云香’NtNAC1已成功导入烟草中，选取条带明亮的2、3、9号株系继续培养，用于后续转基因植株的功能鉴定。
　　2.6  NtNAC1转基因烟草株系抗逆性鉴定
　　T1代阳性株系根长实验发现，正常生长条件下（对照组1/2 MS），野生型与转基因植株根长无明显差别。模拟逆境胁迫下根长均受到不同程度的抑制，野生型植株根系伸长严重受阻，其中ABA处理后，植株根长小于10 mm受抑制程度最严重，甘露醇、NaCl胁迫下，转基因株系根长较野生型发育良好，这表明NtNAC1过表达增强了转基因烟草根系对ABA的敏感性和对干旱、高盐的耐受性。
　　烟草植株WT和3个转基因株系（TP-2、TP-3、TP-9）3～4叶期时进行抗逆性鉴定，对照组正常生长条件，过表达NtNAC1转基因植株和野生型表型无显著差异;实验组15 d胁迫处理后发现，干旱胁迫下转基因烟草相较对照组生长发育迟缓，叶片表面积小，野生型植株叶片开始变黄，而转基因植株长势良好;盐胁迫下大部分植株叶片萎蔫发黄，甚至枯萎，野生型枯萎速度高于转基因植株，表明水仙NtNAC1过表达减轻了逆境胁迫产生的损害，提高了烟草的抗性。
　　不同小写字母表示在相同组织中不同处理时间点的差异显著性（P<0.05）。
　　3  讨论
　　NAC转录因子广泛存在于植物中，参与响应高盐、干旱、低温或高温等非生物胁迫，其基因功能的多效性在转基因应用中非常有益，即通过改变1个NAC基因的表达实现多种定向改良[15]，因此克隆和鉴定优良非生物胁迫相关NAC转录因子具有重要意义。‘云香’水仙较其他多花水仙品种抗性强[16]，本研究利用RT-PCR技术从‘云香’水仙中克隆了1个新的NAC转录因子基因NtNAC1，其编码的蛋白与同一品种‘云香’NtNAC3153蛋白相似性低，在C端几乎没有相同的残基，表明两者分化较久，在功能上可能有所分化。这一现象也出现在其他植物中，包括拟南芥AtNAM[17]、大豆GmNAC1～6[18]、陆地棉GhNAC1～6[19]、鹰嘴豆CarNAC1～6[20]等。进化树分析结果，NtNAC1聚分在SNAC1亚家族。同一亚家族中，小麦TaNAC47在拟南芥中过表达时增加了植株对外源ABA的敏感度，增强了对干旱、盐和低温胁迫的耐受性[21];香蕉MusaSNAC1通过提高干旱胁迫下保卫细胞中H2O2含量来诱导气孔关闭，减少水分损失，从而提高过表达株系的抗旱性[22]。由此，可推测NtNAC1与这些蛋白具有相似功能，即响应逆境胁迫，提高植株的抗性。
　　本研究中，NtNAC1的表達水平主要受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG胁迫诱导，具有时空特异性。这一表达模式不仅与‘云香’NtNAC3153相似，即均能被ABA、高盐诱导（NtNAC1峰值表达量高于NtNAC3153，其基因功能可能更强大），还与SNAC1亚家族其他植物基因类似，例如，拟南芥ANAC019、ANAC072在叶和根中高表达，盐胁迫下叶和根中的表达量上调[23];小麦TaNAC29、TaNAC2D在叶中高表达，根中表达量相对较低，盐、干旱、ABA等非生物胁迫下叶和根中的表达量均急剧上升[24];小麦TaNAC47受ABA、4 ℃、PEG、高盐胁迫诱导表达[21]。显然，抗逆基因的可诱导性有利于植物快速响应不同的逆境，增加在逆境下的生存能力。本文发现，NtNAC1的表达具有时空特异性，比如在根中表达量高、叶中次之;在花瓣和副冠中的表达模式也不同，除可能与这些组织或器官的发育阶段不同对逆境的抵抗力不同这一解释外，我们不能排除该基因还有其他潜在的生物学功能。
　　大量研究表明，通过转基因技术将NAC过表达，能不同程度地提高对非生物胁迫的耐受性。如，小麦TaRNAC1在根系过量表达，可以促进根发育、增加生物量和产量，提高抗旱性[25];陆地棉GhNAC79过表达提高了转基因拟南芥、棉花的抗旱性[26];鹰嘴豆CarNAC6在拟南芥中过表达，促进转基因植株根系生长，提高其对干旱和高盐的耐受性[27]。本研究同样发现，采用农杆菌介导法将水仙NtNAC1转入烟草中过表达，促进了转基因植株的根系发育，增加了干旱和盐胁迫下的存活率，表型观察未发现NtNAC1过表达有明显的负面影响，表明该基因作为抗旱、耐盐的良好遗传资源，在水仙的抗性分子改良上有潜在应用价值。
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