拟南芥rd29A启动子在不同胁迫下GUS活性分析

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　　摘要：通过特异PCR扩增技术，以拟南芥基因组DNA为模板，克隆了rd29A基因上游   1 600 bp的胁迫诱导型启动子序列。将此1 600 bp的调控序列与GUS基因连接构建植物表达载体pBI101-rd29A-GUS，并用农杆菌介导法转基因拟南芥。定量PCR结果显示，干旱胁迫下转基因纯合株系中rd29A显著上调表达。GUS组织化学染色及GUS定量分析结果表明，在ABA、甘露醇和NaCl等胁迫处理下，GUS活性增强，尤其是ABA胁迫处理。说明rd29A启动子可以增强逆境下GUS基因的表达，可作为一种诱导型启动子应用于提高作物抗逆性的基因工程研究中。
　　关键词：rd29A;干旱;ABA;NaCl;甘露醇;小麦
　　中图分类号：S336       文献标志码：A       文章编号：1001-1463（2019）05-0040-07
　　
　　Abstract：About 1600bp stress inducible promoter of rd29A from Arabidopsis thaliana genomic DNA was cloned by PCR. The plant expression vector pBI101-rd29A-GUS was constructed with this regulatory region linked up with GUS gene，and then transferred to Arabidopsis by Agrobacterium tumefaciens system. The expression level of rd29A was up-regulated under drought stress in homozygous seedlings. Histochemical analysis and quantitative analysis results showed that the GUS activity was enhanced under ABA、NaCl and mannitol treatments. Therefore， rd29A prompter can strengthen the expression of GUS gene under stresses， and can be used as an inducible promoter in gene engineering for stress resistance improvement of crops.
　　Key words：rd29A; Drought; ABA; NaCl; Mannitol; Wheat
　　在復杂的自然生境下，农作物的生长发育经常会遭受到干旱、低温、高盐和涝旱等逆境胁迫的影响，进而影响农作物产量[1 ]。近年来，现代生物育种技术在作物育种中的贡献愈加显著，其中利用基因工程技术提高植物抗逆性已成为分子生物学研究的重要领域之一[2 - 3 ]。转基因技术作为一项强有力的工具，在不改变作物原有特性的基础上，可以将控制植物抗逆的关键基因导入其中，从而实现品种改良的目的。然而，大部分的转基因是用CaMV35S植物组成型强启动子驱动目的基因表达，使得目的基因在植物不需要的情况下仍能强烈表达，进而改变植物正常的基因调控和代谢途径，而引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育，造成转基因植物生长缓慢、株型变小等[4 - 6 ]。
　　拟南芥rd29A启动子是逆境诱导型启动子，含有干旱、高盐、低温、ABA诱导表达等相关的顺式作用元件（Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1994），可用于抗逆基因工程。因此，选择合适的逆境诱导型启动子进行克隆以替代CaMV35S启动子与特定的转录因子结合驱动目的基因表达，在提高植物的抗性并减小目的基因过量表达给转基因植物带来的不利影响等方面具有极大的优越性。
　　研究发现，rd29A的表达受多种环境因素诱导，可响应冷、干旱、盐和脱落酸（ABA）等胁迫[7 ]。我们根据拟南芥rd29A起始密码子上游1600bp的启动子序列设计引物，以DNA为模板，克隆获得了该启动子，将其与植物表达载体pBI101-GUS连接，检测了其在不同胁迫下的活性，以期为今后利用该诱导型启动子培育抗性作物品种（如小麦）提供研究基础和应用依据。
　　1   材料与方法
　　1.1   材料
　　1.1.1    供试材料    以拟南芥野生型（Col-0生态型）种子为材料。种子在4 ℃春化3 d后，用15%次氯酸钠消毒，点种在MS培养基上。培养7 d后，取材提取RNA，反转录合成cDNA第一链后进行基因克隆。同时将幼苗移至营养土（土与蛭石按体积比3∶1配制）中，在23 ℃培养室培养（光照16 h、黑暗8 h）28 d左右，用于转基因实验。
　　1.1.2    主要试剂    植物总RNA提取试剂盒（Tiangen）、反转录酶（Thermo Fisher）、MS粉（Duchefa）、高保真酶Prime STAR（Takara）、凝胶回收试剂盒（康润生物）、内切核酸酶（NEB）、SYBR Green I（Takara）、0.2 mL PCR八连管（Bio-Rad）。卡那霉素、利福平、NaCl、甘露醇、Na2HPO4、NaH2PO4、SDS和Na2EDTA·2H2O购自索莱宝，ABA购自Sigma公司，X-Gluc和MUG购自Goldbio公司。Triton X-100、β-巯基乙醇、Na2CO3、考马斯亮蓝G250和牛血清白蛋白BSA购自上海生物工程有限公司。 　　1.2   方法
　　1.2.1    载体构建    参照CTAB法[8 ]提取基因组DNA作为模板。选取rd29A的5’上游序列1 600 bp设计特异性引物进行PCR扩增。引物由华大基因公司合成。将克隆得到的片段回收后，由Hind III酶和XbaI酶进行双酶切，同时对载体pBI101-GUS用相同的酶双酶切后，与酶切片段进行连接，得到由拟南芥rd29A基因启动子驱动的植物表达载体pRD29A-pBI101-GUS。双酶切鉴定获得阳性克隆，测序，序列合适后提取质粒，转入农杆菌GV3101。
　　1.2.2   转基因纯合株系获得   利用浸花法[9 ]，将1.2.1中获得的阳性克隆侵染拟南芥野生型（Col-0），获得T0代种子。将干燥的T0代种子在含卡那霉素的MS培养基上大量播种，挑取有抗性的幼苗移入土中继续培养，单株收取得到T1代种子。将T1代种子按照3∶1的原则继续经卡那霉素筛选，存活的株系单株收种子得到T2代种子。T2代种子继续经抗生素筛选，全部存活没有分离的则定为纯合株系，用于后续实验。
　　1.2.3    定量PCR分析     将纯合株系种子在4 ℃下春化3 d后，用15%次氯酸钠消毒，点种在MS培养基上。7 d后将幼苗移至营养土中，在23 ℃培养室中培养（16 h光照/8 h黑暗）12 d后进行干旱处理。
　　试验设计分为2组，一组为对照组，正常浇水;一组为处理组，不浇水。处理7 d后分别取材。参照植物总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，检测其完整性并测定RNA浓度和纯度。取2 μg RNA，按照反转录酶的说明书进行cDNA合成。反转录后用于定量分析。
　　1.2.4    组织表达分析    纯合株系种子在4 ℃下春化3 d后，用15%次氯酸钠消毒，点种在MS培养基上。7 d后，幼苗移至处理培养基上。试验设计分为4组，对照组不作任何处理，继续在MS培养基上正常生长;其他3组分别为200 mM NaCl处理、150 μM ABA处理，以及300 mM甘露醇处理。处理2 h后，对4组试验取材进行GUS染色。GUS染色按照文献的方法进行[10 ]。
　　1.2.5    GUS活性分析    首先提取植物总蛋白。取200 mg新鲜的植物组织，液氮速冻后迅速磨碎，将研磨后的组织转到1.5 mL离心管里，加入1 mL GUS提取缓冲液[0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.0）50 mL;10% SDS 1 mL;0.5M EDTA（pH 8.0） 2 mL;Triton X-100 100 μL;β-巰基乙醇100 μL;加水定容至100 mL]，充分混匀。4 ℃ 11 600 rpm 离心5 min，将上清转至另一新的离心管中，冰上放置。
　　接着以牛血清白蛋白BSA作标曲，参照Bradford的方法对蛋白浓度进行测定[11 ]。
　　最后对GUS表达水平进行定量分析：取100 μL蛋白上清，加入37 ℃预热的GUS提取缓冲液400 μL后再加入500 μL MUG底物（2 mM），37 ℃温浴。在0 min、15 min、30 min、45 min和60 min时分别取混合反应物200 μL加入到800 μL反应终止液（0.2 M Na2CO3）中，室温下避光保存。利用荧光分光光度计在激发波长365 nm、发射波长455 nm下，狭缝10 nm时测定不同时间点的荧光强度值。以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间荧光强度变化。用单位时间荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求得单位质量的蛋白在单位时间的荧光强度变化。
　　2   结果与分析
　　2.1   rd29A启动子的扩增及酶切鉴定
　　以拟南芥DNA为模板，加入特异性引物（表1）进行扩增。电泳结果（图1）表明，克隆得到约1 600 bp的预期片段（命名为pRD29A）。利用HindIII酶和XbaI酶对目的片段和植物表达载体pBI101-GUS进行双酶切，将pRD29A插入到载体，得到由拟南芥rd29A启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体pBI101-rd29A-GUS。HindIII酶和XbaI酶双酶切鉴定重组克隆（图2），表明rd29A启动子完整的插入到表达载体中，同时通过测序确定为所需阳性克隆。
　　
　　2.2   转基因植株筛选
　　利用农杆菌介导的方法，将上述成功的阳性克隆转基因进入拟南芥中。对转基因获得的种子进行抗生素（卡那霉素）筛选。转基因植株具有抗性，幼苗较绿，根能够伸长生长，未转入成功的植株因缺乏抗性而黄化死去（图3）。多次筛选后获得纯合株系。
　　2.3   干旱胁迫下rd29A及GUS基因表达量变化
　　rd29A是干旱胁迫响应的关键基因，因此检测了干旱胁迫和未处理条件（CK）下转基因纯合株系中rd29A以及GUS报告基因表达量变化。对照组和处理组各取3个生物学重复，提取总RNA后进行凝胶电泳检测。结果显示6个样本的RNA完整性均较好（图4）。测定浓度和纯度后，反转录为cDNA用于实时荧光定量分析。
　　定量分析结果（图5）显示，与对照组相比，干旱处理后rd29A基因显著上调表达，而GUS基因表达略有上调。
　　
　　2.4   GUS染色及活性分析
　　分析了不同胁迫处理下转基因株系中GUS活性是否发生变化。将培养7 d的幼苗经不同处理2 h后进行GUS染色，脱色后在体视显微镜观察。结果（图6）显示，与对照组相比，3种处理下下胚轴、叶片及整株幼苗中GUS活性均升高。其中ABA处理下GUS活性显著高于对照组与其他2个处理组，尤其在子叶中。甘露醇和NaCl处理与对照相比GUS活性略有升高。 　　为进一步分析不同处理下GUS活性变化，将培养7 d的幼苗经不同处理2 h后的GUS活性进行定量分析。结果（图7）显示，与对照组相比，3种处理下GUS活性在整株幼苗中均升高。其中ABA处理下GUS活性高于对照组与其他两个处理组。甘露醇和NaCl处理下与对照相比GUS活性略有升高，这与GUS染色结果一致。
　　3   小结与讨论
　　启动子是提供RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列和相关的调控元件，通常位于基因的上游，驱动基因转录。根据启动子的作用方式，可分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。在作物的遗传转化中，绝大多数用组成型启动子CaMV35S驱动目的基因表达，这可能造成转基因作物的生长发育受到限制，因此诱导型和特异型启动子的研究受到越来越广泛的关注。
　　诱导型启动子通常是指在某些特定的信号刺激下可以大幅度提高基因转录水平的启动子。诱导型启动子对基因表达的调控，可以改善植物在发育过程中对环境变化的适应，同时可避免基因过量表达对植物造成的潜在危害。诱导型启动子包括多种类型：可被激素如脱落酸、生长素等诱导表达的启动子ABRE和E1[12 - 13 ];可在低温、脱水以及高盐等逆境因子的作用下被诱导表达的启动子Fro1、ABA2和Rab16A [14 - 16 ];能够对人工合成的化学诱导物作出反应的启动子IN2-2[17 ]。此外还存在一些能够被光诱导Sgt1[18 - 19 ]和机械创伤诱导Win3 [20 ]表达的启动子类型。
　　rd29A启动子作为诱导型启动子中研究最广泛的启动子，已被许多学者应用于提高转基因作物抗性的育种研究中[21 - 22 ]。rd29A作为DREB1调控的目的基因，其启动子区域含有DRE核心序列和ABA响应的顺式作用元件（ABRE）[23 ]。在植物细胞缺水时，体内产生的ABA通过信号传导，可以产生与rd29A启动子区ABRE序列相结合的转录因子，启动rd29A的表达。同时DREB1转录因子与rd29A启动子DRE核心序列结合也可以诱导该基因的表达。细胞不缺水时rd29A并不表达[24 - 25 ]，因此认为rd29A是一个干旱诱导型启动子。
　　本研究经过定量分析，已经证明干旱胁迫下转基因株系中rd29A显著上调表达。同时通过GUS染色和GUS活性定量分析发现，在ABA、甘露醇和NaCl等非生物胁迫下，转基因株系的叶脉和下胚轴处的GUS染色加深，说明rd29A启动子在胁迫诱导下活性增强，可以有效地驱动GUS基因的表达。前人的研究同样表明将拟南芥rd29A启动子转入烟草中，经GUS染色分析发现胁迫处理下转基因烟草叶脉处蓝色较深[26 ]。
　　Kasuga等[27 ]分别构建了CaMV35S啟动子和rd29A启动子驱动DREB1A基因的表达载体，转基因到拟南芥中区别其抗逆能力。结果显示，CaMV35S驱动的DREB1A基因过表达后激活转基因株系中其他胁迫基因的表达，如rd29A、Kin1、Cor6.6、Cor15a、rd17和P5CS等，虽然具有更强的抗旱、抗盐等能力，但其在正常条件下生长迟缓。而由rd29A驱动的DREB1A基因表达后，转基因株系既可获得更强的胁迫耐性，同时植株生长受到的影响较小。因此rd29A诱导型启动子在植物抗逆基因工程中具有广泛的应用前景和极大的研究价值。我们在前人的基础上构建了Rd29A启动驱动的GUS基因表达，不仅在组织染色水平上验证了其在干旱胁迫条件下的响应，同时多角度做了关联验证，如自身RD29A基因的诱导表达分析，GUS活性定量分析，更加精确地明确了Rd29A启动子的功能。希望通过进一步构建rd29A干旱诱导型启动子驱动DREB转录因子的植物表达载体，利用农杆菌介导法将其成功转入小麦中，以提高甘肃旱地小麦产量。
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　　（本文责编：陈     珩）
　　收稿日期：2019 - 03 - 06
　　基金项目：国家自然科学基金项目（31560390）;甘肃省科技重大专项（17ZD2NA016-7）;甘肃省小麦产业技术体系（GARS-01-01）;公益性行业农业科研专项（201503125-1）资助。
　　作者简介：柳   娜（1981 — ），女，甘肃靖远人，副研究员，主要从事小麦分子和常规育种工作。Email：592905658@qq.com。
　　通信作者：杨文雄（1964 — ），男，甘肃会宁人，研究员，主要从事小麦育种研究工作。Email：ywxm822@126.com。
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