烟草不同叶位多酚含量及相关酶活性变化的研究

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　　摘要：为分析烟叶在生长过程中的次生代谢物质动态变化特征、相关酶的活性变化规律，以3个烤烟种植试验点的烤烟为研究对象，研究不同叶位烟草叶片多酚类物质含量、抗氧化活性和表达量。结果表明，同一个采样点中，不同叶位烟叶多酚类物质含量表现为上叶位>中叶位>下叶位。不同叶位烟草叶片PAL、PPO、C4H和4CL活性以上叶位最高。通过多酚体外抗氧化测定，表明不同叶位多酚对DPPH和羟基自由基有一定的清除能力。荧光定量PCR检测发现，PAL基因和PPO基因在上叶位中的表达显著高于其他叶位。烤烟生长过程中的次生代谢物质动态变化，相关酶的活性变化及基因表达水平与烟叶成熟度存在一定的关联。
　　关键词：烟草;不同叶位;多酚;酶活性;抗氧化活性
　　中图分类号：S572         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）09-0080-06
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.018           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Aiming to analyze the dynamic changes of secondary metabolites and related enzymes during tobacco growth， the content， antioxidant activity and expression level of polyphenols in tobacco leaves at different leaf positions were studied in three tobacco planting experimental sites. In the same sampling site， the content of polyphenols in tobacco leaves of different leaf positions showed as follows：upper leaf position>middle leaf position>lower leaf position. The activities of PAL， PPO， C4H and 4CL in tobacco leaves at different positions showed that the enzyme activity in the upper leaves was the highest. The antioxidant activity of polyphenols in vitro showed that polyphenols in different leaf positions had certain scavenging ability to DPPH and hydroxyl free radicals. q-PCR analysis showed that the expression of PAL and PPO genes in the upper leaf was significantly higher than that of other leaf positions. Dynamic changes of secondary metabolites， enzyme activity and gene expression levels were correlated with tobacco maturity during the growth of flue-cured tobacco.
　　Key words： tobacco; different leaf positions; polyphenols; enzyme activity; antioxidant activity
　　烟草体内的糖类、脂类和蛋白质经过代谢后产生了酚类化合物，存在于烟草叶片和烟气中，在其生长和发育、香气味产生、产品调制、烟叶颜色和光泽等方面起着重要的作用[1，2]。烟草叶片的多酚类物质主要包含芸香苷、绿原酸和莨菪亭，其中含量较高的绿原酸和芸香苷占烟叶总酚化合物含量的75%～95%[3]。
　　多酚类物质是由芳香族氨基酸脱氨经由肉桂酸和香豆素形成的，它是植物体中苯丙烷代谢途径重要的代谢产物，多酚类物质含量与烟草品质形成有着紧密的联系，研究表明多酚类物质可提高烟草植株在逆境胁迫中抗逆能力和抗氧化水平[4-6]。Zucker等[7]研究表明多酚化合物在烟草植株的不同部位含量不同，叶中累积量较大，茎和根中累积量少。成熟烟株不同叶位的多酚含量从上部叶到下部叶逐渐降低，其中上部叶绿原酸含量最高，达到4.22%，下部叶绿原酸含量为3.14%，达到最低值[8]。
　　烤烟次生代谢在生态条件差异下，对烟草的内在物质含量及积累都有重要影响。在不同生态条件下，烟叶的内在质量相差很大，不同地区、不同品种其品质相差很大，烟叶多酚不仅是衡量烟叶质量的一个重要因子，与烟草植株的生长及烟叶发育、抗逆性都有着相关性，影响烟叶多酚合成的因素包括烟叶部位、成熟度以及水分、温度、湿度、日照、栽培措施等因子。研究发现烟株内多酚类物质可以在不同部位间转移，绿原酸的合成可以在烟草叶片和茎中进行，但根中不能合成，在开花时期的光周期誘导作用下，绿原酸在成熟植株中从上部转移到根部[9]。多酚类化合物含量与烟叶等级相一致，等级高的烟叶多酚含量较高[10]，等级较好的烟叶中绿原酸和芸香苷的含量也较高[2]，低等级烟叶的多酚含量低[10]。
　　酚类化合物在烟草生长发育过程中，其生成过程和累积过程与相关酶类，包括多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）等生理活性有着紧密的联系[11]。PPO是一种含有Cu2+的结构蛋白，能进行多酚类物质上的羟基的催化，使之发生氧化反应并转化为醌，细胞内的氨基酸与醌能发生聚合反应形成色素产生沉淀[11]。前人的研究工作主要关注烟草调制过程中烟叶中多酚化合物及其相关酶的活性研究，但针对整个烟株生长发育过程尚缺乏多酚类物质的含量及其相关酶活性变化的关联性研究分析。 　　本研究以云南省昆明3个烤烟种植试验点的烤烟为研究对象，研究品种与不同叶位间多酚类物质积累的差异，探讨提高烟叶品质的最适效应。考察不同叶位烟草叶片多酚类物质含量，分析其抗氧化活性和表达量，以期为烟草种植、烟叶生产管理及烟叶品质提高提供参考。进一步掌握次生代谢产物对烟叶的品质影响，为合理调控烟叶的发育进程提供理论依据与技术支撑。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料
　　以云南省昆明烤烟为研究对象，分别选取宜良县和石林县的3个烤烟种植试验点，供试材料品种为红花大金元（宜良县）和K326（石林县）。采摘成熟期烟草叶片，根据叶片（上部叶片完全展开，下部叶片不失绿）在茎秆上的着生位置，从上到下依次为上、中、下叶位。采样具体信息见表1。
　　1.2  试验方法
　　1.2.1  多酚类物质含量测定  取样后干燥烟草叶片，粉碎后过80目筛。称取4 g烟草样品在提取温度75 ℃、乙醇浓度（V/V）50%、液料比20 mL/g提取条件下回流提取50 min，提取完毕后趁热过滤，待滤液冷却至室温后用提取溶剂定容至100 mL，得烟草多酚提取液。
　　根据Folin-Ciocalte法，绘制没食子酸标准曲线，在540 nm波长下测定样品的吸光度，计算烟草提取液中多酚提取率。烟草多酚提取液中多酚浓度可由没食子酸标准曲线的回归方程计算得出，并按照公式得出烟草多酚提取率。
　　式中，C为多酚浓度（mg/mL）;Va为容量瓶量程（100 mL）;Vb为提取液总体积（100 mL）;M为样品质量（4 g）;V为取液量（10 mL）。
　　1.2.2  酶活性测定  采用紫外分光光度法利用 PAL活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性，肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）活性参照Kong等[12]的方法测定。
　　1.2.3  抗氧化活性测定
　　1）不同浓度提取液的配制。将烟草多酚提取液稀释成多酚浓度梯度为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的溶液。配制浓度梯度为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的维生素C溶液。
　　2）测定DPPH清除率。DPPH无水乙醇溶液为紫色，被还原时退色，且退色程度与清除率呈正比，在517 nm处有特征吸收。以维生素C为对照，测定烟草不同叶位多酚对DPPH的清除能力。
　　根据李西柳等[13]的方法测定。测定清除DPPH的能力，先配制0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液于棕色瓶中并于0～4 ℃保存。分别准确量取上述溶液2 mL于试管中，再加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液，室温下反应30 min;将DPPH无水乙醇溶液和烟草多酚溶液用等浓度乙醇置换，重复上述步骤，在517 nm处测定吸光度X1、X2和X0。重复两次取平均值，根据公式计算：
　　3）测定羟基自由基清除率。生物体内活性最强的氧自由基是羟基自由基，所以评价抗氧化活性的重要指标之一就是清除羟基自由基的能力。以维生素C为对照，测定烟草不同叶位多酚对羟基自由基的清除能力。
　　根据吴林秀等[14]的方法测定。采用的水杨酸钠络合法测定，先分别准确量取上述溶液2 mL于试管中，再加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L H2O2各2 mL于试管室温下反应20 min。然后分别加入9 mmol/L水杨酸钠溶液2 mL室温下反应20 min。将水杨酸钠溶液和烟草多酚溶液用等量蒸馏水置换，重复上述步骤，在510 nm处测定吸光度X1、X2和X0。重复两次取平均值，根据公式计算：
　　4）引物设计及表达量测定。对各处理样品的cDNA模板进行PAL基因表达量的测定。RT-qPCR体系按照SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）操作指南进行。荧光定量使用Master cycler ep realplex 2S（Eppendorf）。使用Real Time PCR荧光定量仪进行相对实时荧光定量PCR。扩增反应体系为20 μL∶10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，5 μL（50 ng/L） cDNA 模板，正、反引物各1 μL，3 μL ddH2O。反应条件为：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环，72 ℃单点检测信号。以烟草Actin作为内参基因，每个样品RT-qPCR采用3 次重复，运用2-ΔΔCT算法分析各基因的表达量。
　　根据qRT-PCR引物设计的要求，采用Primer 5.0软件进行引物设计（表2）。以Actin为内参基因，采用2-ΔΔCT法进行基因相对定量分析。
　　1.3  数据处理
　　采用SPSS 19.0軟件进行LSD多重比较法方差分析，Excel和Origin 9.1软件制作图表。
　　2  结果与分析
　　2.1  不同叶位烟叶的多酚提取率
　　从图1可以看出，宜良县3个采样点的9个样品，不同叶位烟草叶片多酚提取率存在着明显差异，其中1号采样点的3号样（上叶位）的多酚提取率最高，是同个采样点的中叶位和下叶位提取率的1.29和1.78倍。
　　从图2可以看出，石林县3个采样点的9个样品，不同叶位烟草叶片多酚提取率存在着明显差异，其中3号采样点的18号样（上叶位）的多酚提取率最高，是同个采样点的中叶位和下叶位提取率的1.61和1.67倍。 　　2.2  不同叶位烟草叶片PAL、PPO、C4H和4CL活性分析
　　由图3可知，不同叶位烟草叶片PAL活性随着叶位的不同呈现不同的趋势，其中宜良县和石林县所有采样点上叶位PAL活性均大于中叶位和下叶位。宜良县3号采样点的9号样和石林县3号采样点的18号样PAL活性明显高于其他叶位。
　　由图4可知，不同叶位烟草叶片PPO活性随着叶位的不同呈现不同的趋势，其中宜良县和石林县所有采样点上叶位PPO活性均大于中叶位和下叶位。宜良县3号采样点的9号样和石林县3号采样点的18号样PAL活性明显高于其他叶位。
　　由图5可知，不同叶位烟草叶片C4H活性随着叶位的不同呈现不同的趋势，其中宜良县和石林县所有采样点上叶位C4H活性均大于中叶位和下叶位。宜良县3号采样点的9号样和石林县3号采样点的18号样C4H活性明显高于其他叶位。
　　由图6可知，不同叶位烟草叶片4CL活性随着叶位的不同呈现不同的趋势，其中宜良县和石林县所有采样点上叶位4CL活性均大于中叶位和下叶位。宜良县的3号样和9号样及石林县的12号样和18号样4CL活性明显高于其他叶位。
　　2.3  不同叶位烟叶多酚体外抗氧化结果
　　2.3.1  清除DPPH结果与分析  由表3可知，随着不同叶位烟叶多酚提取液和维生素C浓度的增加，对DPPH的清除率也在逐渐增大，呈现出浓度依赖性。经计算烟叶多酚提取液的IC50为0.0019 mg/mL。当18号样品浓度到达0.006 mg/mL时，其清除率可达到80.94%，当浓度到达0.005 mg/mL以后，对DPPH的清除率趋于稳定;而维生素C的IC50为0.000 6 mg/mL，IC50越小表示其抗氧化能力越强，说明不同叶位烟叶多酚对DPPH有一定的清除能力，但清除能力较维生素C稍弱。
　　2.3.2  清除羟基自由基结果与分析  由表4可知，随着烟草叶片多酚提取液和维生素C浓度的增加，对羟基自由基的清除率也在逐渐增大，呈现出浓度依赖性。经计算烟叶多酚提取液的IC50为0.003 7 mg/mL。当18号样品浓度到达0.006 mg/mL时，其清除率可达78.67%，当浓度到达0.005 mg/mL以后，对羟基自由基的清除率趋于稳定;而维生素C的IC50为0.000 6 mg/mL，IC50越小表示其抗氧化能力越强，说明不同叶位烟叶多酚对羟基自由基有一定的清除能力，但清除能力较维生素C稍弱。
　　2.4  不同叶位烟叶PAL和PPO基因表达分析
　　荧光定量PCR检测发现，PAL基因主要在上部叶中的表达量最高，其次是在中部叶，下部叶中的表达量最低（图7）。随着叶位的不同呈现不同的表达趋势。其中，宜良县采样点的3号样、9号样和石林县的18号样PAL基因表达显著高于其他叶位。PPO基因均在上部叶中的表达量最高，表达量最低的叶位是下叶位（图8），宜良县采样点的3号样、6号样和9号样与石林县采样點的12号样、15号样和18号样PPO基因在上叶位中的表达明显高于其他叶位。
　　3  小结与讨论
　　成熟度是决定烟草品质的一个主要因素，研究表明由于成熟度差异烟叶中内含物累积的不同，影响着原烟产品质量和品质，成熟度不同的烟叶，其多酚化合物含量有明显的差异[15，16]。王丹等[17]研究了2个烤烟品种在不同成熟期多酚化合物及氧化酶活性的变化，结果发现随着烟叶的成熟，叶片中的多酚和抗坏血酸的含量逐渐升高，多酚氧化酶和过氧化物酶活性在适熟时达到最高。
　　由于不同地区的环境影响因素不同，使在不同地区种植同一烟草品种时，会存在生长状态和内部化学成分含量差异的情况。烟叶在发育过程中，其多酚化合物含量随着烟叶的成熟度变化，烟叶过熟时多酚化合物含量呈现下降趋势。本研究结果表明，不同叶位烟叶多酚类物质含量呈现出上叶位较高趋势，中叶位次之，下叶位叶片的多酚类物质含量最低。通过测定不同叶位烟草叶片PAL、PPO、C4H和4CL活性，结果表明上叶位、中叶位和下叶位烟草叶片的酶活性随着叶位的不同呈现出不同的趋势。相关研究表明，青黄叶、大叶黄和大白花3个品种中，苯丙氨酸解氨酶活性与绿原酸和芸香苷的变化规律相同，多酚氧化酶活性和过氧化物酶活性呈单峰趋势。孟莉等[18]的研究发现多酚氧化酶活性在烟叶生长过程中和总酚的含量呈现出负相关趋势，过氧化物酶活性与总酚的含量呈现出正相关趋势。袁卫瑜等[19]发现打顶后能提高烟叶多酚类物质的含量，烟叶成熟度增加后，中部叶的多酚总量提高，而上部叶多酚总量下降，同时还发现中部叶和上部叶的PAL活性与其他酚类物质含量均呈正相关，PPO活性与酚类物质含量均呈负相关。打顶诱导烟叶多酚生物合成与生育期有关，杨银菊等[20]发现苗期打顶后，烟叶中多酚含量降低，而现蕾后打顶烟叶中多酚含量升高。
　　在烟草生长过程中，多酚是植物中重要的次生代谢产物和生物活性物质，烟叶中多酚含量的变化与烟株生长状态密切相关，其中光是影响植物多酚含量的重要非生物因素，从烟草K326中分离到光敏色素B同系物NTFYB1，分析了其光受体在烟草多酚代谢调控中的作用，结果表明NtPHYB1参与烟草叶片多酚代谢的调节，其表达有利于绿原酸及其异构体的积累，同时NtPHYB1可调节PAL4、4CL1和COMT基因的转录[21]。
　　同一个采样点中，不同叶位烟叶多酚类物质含量表现为上叶位>中叶位>下叶位。不同叶位烟草叶片PAL、PPO、C4H和4CL活性结果表明，上叶位的酶活性最高。通过多酚体外抗氧化测定，表明不同叶位多酚对DPPH和羟基自由有一定的清除能力。荧光定量PCR检测发现，PAL基因和PPO基因在上叶位的表达明显高于其他叶位。
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　　收稿日期：2018-09-30
　　基金项目：中国烟草总公司云南省公司重点资助项目“基于品牌导向的烟叶定向需求技术研究与应用”（2017YN12）
　　作者简介：李晓宁（1981-），女，山西大同人，讲师，硕士，主要从事土壤化学的研究工作，（电话）0871-65227651（电子信箱）14576221@qq.com;通信作者，赵  艳（1982-），女，高级实验师，博士，主要从事生物化学的研究工作，（电话）0871-65220462（电子信箱）zhaoyankm@126.com。
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