槐花饮片标准汤剂研究
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摘要：目的 制备槐花饮片标准汤剂，并建立质量控制方法。方法 制备15批槐花饮片标准汤剂，以总黄酮和芦丁为检测指标，计算出膏率、指标成分含量和转移率，并建立超高液相色谱（UPLC）特征图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行分析和相似度评价。结果 15批槐花饮片标准汤剂出膏率为28.7%～39.7%;总黄酮含量为158.07～210.55 mg/g，转移率为49.46%～73.19%;芦丁含量为105.26～127.35 mg/g，转移率为41.30%～75.67%。15批槐花饮片标准汤剂UPLC特征图谱标定了9个共有峰，并指认芦丁1个色谱峰，通过与对照图谱比对，相似度均高于0.99。结论 本研究建立了槐花饮片标准汤剂的质量评价方法，且准确、稳定、重复性良好，可为槐花配方颗粒的质量控制提供参考。
关键词：槐花饮片;标准汤剂;配方颗粒;特征图谱;芦丁
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）06-0086-06
Abstract： Objective To prepare standard decoction of Sophorae Flos decoction pieces; To establish the method of quality control. Methods Fifteen batches of standard decoction of Sophorae Flos decoction pieces were prepared. With total favonoids and rutin as the detection index， the extraction rate， content and transfer rate of index components were calculated and the UPLC characteristic chromatograms was established. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Results The extractum rate of 15 batches of Sophorae Flos decoction pieces was at the range of 28.7%–39.7%; the content of total favonoids ranged from 158.07 mg/g to 210.55 mg/g and transfer rate ranged from 49.46% to 73.19%; the content of rutin ranged from 105.26 mg/g to 127.35 mg/g and transfer rate ranged from 41.30% to 75.67%. UPLC characteristic chromatograms of 15 batches of standard decoction marked nine common chrmatographic peaks and identified one chromatographic peak of rutin. The similarity was higher than 0.99 by comparison with the control map. Conclusion The quality control method of Sophorae Flos decoction pieces was established. The method is accurate， stable and with good repeatability， which can provide a reference for the quality control of formula granules of Sophorae Flos.
Keywords： Sophorae Flos decoction pieces; standard decoction; formula granules; characteristic chromatogram; rutin
蕾及花。槐花始載于《日华子诸家本草》：“治五痔，心痛，眼赤，杀腹脏虫及热，治皮肤风，及肠风泻血，赤白痢。”《医学启源》谓其“凉大肠热”，《本草纲目》载：“炒香频嚼，治失音及喉痹，又疗吐血、衄、崩中漏下。”槐花性微寒，味苦，归肝、大肠经，具有凉血止血、清肝泻火功效，用于治疗便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕[1-2]。槐花的化学成分主要包括黄酮及皂苷类，其中黄酮类是主要药效成分，以芦丁含量较高[3-4]。药理学研究表明，槐花水浸剂能显著缩短出血和凝血时间，制炭后其凝血作用增强，煎液具有减少心肌耗氧量、保护心功能的作用;其主要成分芦丁对大肠埃希氏杆菌、金黄色葡萄球菌、水疱性口炎病毒有明显抑制作用，还能降低毛细血管的异常通透性、脆性，可用于高血压、脑溢血、出血的治疗和预防，能维持血管抵抗力等，还可使蟾蜍下肢及兔耳血管收缩[5-7]。
随着社会的发展，配方颗粒及破壁饮片等多种中药饮片应用形式应运而生并广泛应用于临床，同时也存在质量标准不明确和剂量不统一等问题。原国家食品药品监督管理总局为了规范配方颗粒的管理，起草了《中药配方颗粒管理办法（征求意见稿）》[8]，国家药典委员会随后发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》[9]，并提出标准汤剂一词，规定中药配方颗粒的所有药学研究均应与标准汤剂进行比对，保证两者质量一致性。标准汤剂的制备遵循传统汤剂的煎煮原则，对工艺流程要求规范化和标准化，保证临床用药的准确性[10]。中药饮片标准汤剂失去了原有的饮片形态，仅靠指标成分的定性和定量测定难以保证其质量，以特征图谱为主的整体质量控制方法越来越受到重视。本研究采用15批槐花饮片制备标准汤剂，考察总黄酮和芦丁的含量、转移率及出膏率的范围，建立槐花标准汤剂超高液相色谱（UPLC）特征图谱，为槐花配方颗粒及源于槐花水煎液的制剂质量控制提供参考。 1 仪器与试药
岛津高效液相色谱仪，包括LC-15C泵、SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱、岛津LC色谱工作站;超高效液相色谱仪Waters UPLC H-Class，Empower色谱工作站;TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;TB-215D、BSA224S-CW电子分析天平，北京赛多利斯;JY10001型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司;KQ-250型超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司;RE-3000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;FD-1C-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司;BJH-W200F型陶瓷自动中药煲（电源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），广东天际电器股份有限公司。
芦丁（批号100080-201610），中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher，USA），水为超纯水和纯化水，其他试剂均为分析纯。15批槐花饮片来源见表1，神威药业集团有限公司提供，经河北省药品检验研究院孙宝惠主任药师鉴定为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花蕾及花。
2 方法与结果
2.1 槐花饮片的检测
按2015年版《中华人民共和国药典》（一部）槐花飲片项下规定进行检测。15批槐花饮片的含水量为8.66%～10.20%，总灰分为8.60%～13.80%，酸不溶性灰分为2.1%～6.1%，浸出物为37.5%～52.1%，总黄酮含量为8.5%～12.5%，芦丁含量为6.7%～10.9%，均符合规定。
2.2 标准汤剂的制备
称取槐花饮片100.0 g，煎煮2次，一煎加水12倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，趁热用200目筛网分离煎液，二煎加水10倍，武火煮沸，文火保持微沸20 min，趁热用200目筛网分离煎液，合并2次煎液，迅速冷却，60 ℃真空减压浓缩至密度约为1.02～1.05时，测定pH值和密度，放入冰柜（-40 ℃）冷冻过夜，然后冷冻干燥，得干膏粉，以干膏粉计算出膏率。
2.3 标准汤剂定量测定
2.3.1 芦丁含量测定
2.3.1.1 色谱条件与系统适用性
采用岛津Wondasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇-1%冰醋酸（32∶68），流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为257 nm，进样量为5 ?L，理论板数按芦丁峰计算应不低于2000。
2.3.1.2 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品5.38 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品母液。精密量取母液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得浓度为0.105 4 mg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液2.5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.052 7 mg/mL的对照品溶液。
2.3.1.3 供试品溶液的制备
精密称取槐花饮片标准汤剂干膏粉约0.05 g，置100 mL量瓶中，加甲醇95 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得。
2.3.1.4 测定法
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5 ?L，注入液相色谱仪，测定，色谱图见图1。
2.3.2 总黄酮含量测定
2.3.2.1 对照品溶液的制备
取芦丁对照品51.14 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2.5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3.2.2 标准曲线的制备
精密量取上述对照品溶液2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，混匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0401紫外-可见分光光度法，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.3.2.3 测定法
取本品粉末约0.05 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇45 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，取出，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，按“2.3.2.2”项下方法，自“加水至6 mL”起，依法测定吸光度，按标准曲线计算供试品溶液中总黄酮的含量。
2.3.3 样品测定
按上述方法对15批槐花饮片标准汤剂进行测定。结果15批标准汤剂出膏率为28.7%～39.7%，平均34.31%;芦丁含量为105.26～127.35 mg/g，平均116.68 mg/g，转移率为41.30%～75.67%，平均51.23%;总黄酮含量为158.07～210.55 mg/g，平均184.14 mg/g，转移率为49.46%～73.19%，平均61.19%。见表2。
2.4 特征图谱分析 2.4.1 色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表3，检测波长为257 nm，流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为1 ?L。
2.4.2 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品5.38 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品母液。精密量取母液1 mL至10 mL容量瓶，加甲醇稀释至刻度，即得浓度为0.105 4 mg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液2.5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.052 7 mg/mL的对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液的制备
精密称取槐花饮片标准汤剂干膏粉约0.05 g，置100 mL量瓶中，加甲醇95 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得。
2.4.4 特征图谱的建立及相似度评价
精密称取15批槐花饮片标准汤剂约0.05 g，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。将15批槐花饮片标准汤剂的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，通过多点校正将色谱峰自动匹配，生成对照图谱，标定了9个共有峰，并指认芦丁1个色谱峰，因芦丁色谱峰的峰形好、较高且稳定，故选择为参照峰。结果见图2、图3。
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件对15批槐花饮片标准汤剂特征图谱进行相似度评价，结果S1～S15特征图谱与共有模式对照指纹图谱相似度分别为1.000、1.000、0.999、0.999、0.999、1.000、0.999、0.998、0.999、1.000、0.996、1.000、1.000、0.996、0.995，均在0.99以上，符合特征圖谱相似度要求。选取芦丁色谱峰（3号峰）作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果相对保留时间RSD均小于0.2%，相对峰面积RSD介于5.63%～33.04%。见表4。
3 讨论
指标成分含量测定和特征图谱建立的供试品溶液制备时，本试验分别对提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）和超声提取时间（10、20、30 min）进行了考察。结果表明，50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇对芦丁的含量测定结果无明显影响，而经70%甲醇、100%甲醇提取所得特征图谱较50%甲醇提取的色谱峰多且峰面积较大;提取时间对含量测定和特征图谱无明显影响，参照2015年版《中华人民共和国药典》槐花项下含量测定方法，最终选择100%甲醇超声10 min对样品进行提取。同时，本试验对特征图谱采用DAD检测器进行全波长扫描，最终发现在波长为257 nm时色谱峰数目较多且峰形较好，故选定257 nm为检测波长。
本试验所选择的标准汤剂制备工艺是根据《医疗机构中药煎药室管理规范》和国家药典委员会公布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》的要求进行煎煮后，经过固液分离、浓缩、冷冻干燥制成样品。其中，煎药器具的材质对于保证药物化学成分具有至关重要的作用。南北朝时陶弘景提出“温汤忌用铁器”，李时珍又提到“煎药并忌用铜铁器，宜银器、瓦罐”[11-12]。本试验所用为陶瓷材质的煎药壶，其壶口小，对挥发性成分和水分具有保护作用，从而提高煎煮效率，保证药物疗效。对于加水量，《太平圣惠方》提到“凡煮汤……其水数依方多少，不得参差”，可以看出加水量的重要性，不同药性的药物不可一概而论。在煎煮时间方面，由于不同的药物具有不同的药性，所需煎煮时间也不尽相同，有些药物的成分会随着煎煮时间延长而遭到破坏，易挥发物质损失会导致药效降低。槐花为凉血止血药，属于一般类药物，故本试验结合标准汤剂制备工艺要求，加水量以浸过药面2～5 cm为宜，最终选择一煎加水12倍，二煎加水10倍，煎煮时间选择一煎30 min，二煎20 min[13-14]。
本试验制备了15批槐花饮片标准汤剂，其出膏率范围在28.7%～39.7%，采用HPLC测定芦丁的含量介于105.26～127.35 mg/g、转移率介于41.30%～75.67%，总黄酮含量介于158.07～210.55 mg/g、转移率介于49.46%～73.19%。采用UPLC建立了槐花饮片标准汤剂的特征图谱，标定了9个共有峰，指认了芦丁1个色谱峰，15批槐花饮片标准汤剂与对照图谱的相似度均大于0.99。特征图谱克服了单一成分测定信息量不全的缺点，可以更加全面、可靠地控制槐花标准汤剂的质量。方法学考察结果表明，精密度、重复性、稳定性RSD均小于3%，表明本方法准确、可行、重复性良好，能为槐花配方颗粒的质量控制和临床用药提供数据参考。
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（收稿日期：2018-07-02）
（修回日期：2018-08-12;编辑：陈静）
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