基于RAPD分析的李子新品种鉴定

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　　摘要：以改进CTAB法对玉皇李和未鉴定新品种叶片基因组DNA的提取进行了试验。结果表明，该方法从这2个品种李树叶片中均能提出基因组总DNA，且DNA的纯度和完整性均较好，OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，无降解现象，PNA去除干净;此外，运用RAPD标记方法对这2个李品种基因组总DNA进行了PCR扩增，其PAPD分析条带清晰，用20条随机引物共扩增出114条带，平均每条引物扩增出5.7条条带，扩增片段长度为200～2000bp，其中P6、P7、P10、P14和P16 5条随机引物可以单引物区分这2个品种，共获得20个条带，其中差异条带有6个，表明这6个位点存在差异。因RAPD每条扩增谱带对应基因组DNA分子上的一个位点，说明供试品种间DNA位点存在差异，表明未鉴定新品种在栽培过程中发生突变和分化，可能是1个优良种源。
　　关键词：李;成熟叶片;DNA提取;RAPD
　　随着分子生物学的发展，分子标记技术以其简单、快捷、实用等优势而成为植物遗传育种领域研究的有力工具之一，RFLP（restriction fragment length polymor-phism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）和SSR（simple sequence repeats）等多种分子标记技术已广泛应用于多种植物的遗传多样性、亲缘关系、遗传图谱构建及进行分子辅助育种等多方面的研究，而制备高质量的DNA是进行分子标记的基础。植物DNA的提取方法很多，但如何在这些技术操作过程中获得高质量DNA样品是广大生物技术工作者关心的问题。
　　不同植物或同种植物的不同组织具有其各自的特点，其次生代谢产物的种类和含量差异很大，所以很难用一种方法来提取不同植物的DNA。果树成熟叶片中多糖、多酚和其他生物质含量较高，提取高质量的基因组DNA具有一定的难度，原因是在提取DNA过程中多糖及酚类去除不彻底，与DNA共沉淀，呈黏稠的胶状物而难以溶解，而且多糖及酚类物质会严重抑制Taq DNA聚合酶的活性而影响扩增的效果。李属植物（prunus L.）叶片基因组DNA的提取已有一些研究，我们最初参照这些方法提取玉皇李和未鉴定新品种叶片基因组DNA，但提取的效果均不甚理想。为此，在预备实验的基础上，我们对植物基因组DNA提取方法进行了适当改良以满足小批量DNA提取的需要，通过RAPD扩增获得了适宜于RAPD扩增的中国李基因组DNA的方法。
　　DNA分子标记技术是直接利用植物DNA分子水平上的差异来进行鉴别，其结果不受环境和地理因素的影响，更加准确、可靠。目前应用较为广泛的DNA分子标记技术是RAPD技术。RAPD技术是一种使用随机引物快速反映DNA多态性的分子标记技术，广泛地应用于遗传多样性、近缘关系、品种鉴别等的研究中。Khadivi等应用RAPD标记并结合形态学标记对28个伊朗本土甜樱桃和11个国外甜樱桃品种的遗传多样性进行分析，表明品种之间存在着高度的遗传变异。Boonpra-kob等用RAPD多态性标记分别对加利福尼亚州和美国东南地区的日本李和中国李、欧洲李以及美国本土杂交李品种亲缘关系进行分析。Lu等旧用6个RAPD引物就区分了18个桃砧木品种，聚类分析结果与以前系谱分析完全吻合，证明RAlPD技术能够进行桃品种鉴定。
　　本试验中运用RAPD标记方法对2个李品种基因组总DNA进行了PCR扩增，其RAPD分析条带清晰，用20条随机引物共扩增出114条带，平均每条引物扩增出5.7条条带，扩增片段长度为200～2000bp。20条随机引物中有5条可以单引物区分这2个品种，其中差异条带有6个（表3），表明这6个位点存在差异。这有效地区分这2种品种，因RAPD每一条扩增谱带对应基因组DNA分子上的一个位点，试验结果说明供试品种间DNA位点存在差异，这表明未鉴定新品种在栽培过程中发生突变和分化，可能是1个优良种源。
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　试验李品种为玉皇李和未鉴定新品种。这些品种的叶片采于宁夏吴忠。取秋季老叶，用清水冲洗吸干后置于-80℃冰箱中贮藏备用。
　　2.2完整性检测
　　改进CTAB法提取的DNA呈无色透明的絮状沉淀，DNA样液琼脂糖凝胶电泳分析图谱见图1，从中可以看出2种品种的李子成熟叶片均提出了较完整的基因组DNA，无RNA污染，也未发生明显降解现象，适合RAPD扩增分析。
　　2.3基因组DNA的RAPD扩增结果
　　为验证提取DNA样品进行PCR扩增的适用性，用该法共提取了2个中国李品种基因组DNA样品用于PCR扩增，扩增结果电泳图谱见图2。从图2中可以看出，除了2对引物，2个样品均有较清晰的扩增产物，说明改良后CTAB法提取的玉皇李和未鉴定新品种叶片基因组DNA能满足RAPD分子标记研究的需求。
　　此外，琼脂糖凝胶电泳统计结果显示，20条引物在2个品种中共扩增出114条带，平均每条引物扩增出5.7条条带，扩增片段长度为200～2000bp。其中P6、P7、P10、P14、和P18 5条随机引物可以单引物区分这2个品种，共獲得20个条带，其中差异条带有6个（表3），表明这6个位点存在差异。因RAPD每一条扩增谱带对应基因组DNA分子上的一个位点，试验结果说明，供试品种间DNA位点存在差异，这表明未鉴定新品种在栽培过程中发生突变和分化，可能是1个优良种源。
　　3讨论
　　在成熟的李叶片中多糖及酚类等次生物质含量较高，提取高质量的基因组DNA具有一定的难度。在本实验初期，我们曾用玉皇李成熟叶片DNA提取方法，但提取的DNA沉淀呈黏稠状，难以溶解于TE溶液中，且多糖类杂质裹挟着DNA，在去除多糖类物质时同时也将基因组DNA去除。电泳时DNA由于被多糖类杂质包裹而常常聚集在点样孔处，这造成点样孔挤压成圆弧形，点样孔处的亮度远远强于DNA带。 　　CTAB法被认为是从多糖类含量高的植物中提取DNA较理想的方法，因为在高离子强度溶液中，CTAB能与蛋白质及大多数酸性多糖以外的多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。为了有效地去除多糖和多酚类等物质的干扰，我们在此方法的基础上又做了进一步的改进：①用CTAB-free有效除去多糖及酚类物质，然后再用裂解缓冲液裂解细胞核使DNA释放出来，利用CTAB在高离子强度的溶液里（>0.7 mol/L NaCl），易与蛋白质和大多数多糖形成复合物，及0.7 mol/L的NaCl对多糖类物质的溶解作用，进一步降低了多糖类等杂质对DNA提取的影响;②CTAB裂解液和提取缓冲液中的5%β-巯基乙醇对酚类物质氧化的抑制作用，再加上提取缓冲液中3%的可溶性PVP与酚类物质的结合作用，也有效地去除了多酚类物质对DNA提取的干扰;③在氯仿/异戊醇（24：1）及酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提过程中加入的1/10体积CTAB/NaCl溶液，进一步降低了多糖类物质对DNA提取的影响;④在氯仿/异戊醇（24：1）抽提后的水相中加入1/2体积5mol/L的NaCl溶液，可使残留的多糖类等物质充分溶解，随后加入的乙醇，可选择性沉淀DNA，达到了分离纯化DNA的目的。
　　RAPD具有操作简单、准确，对工作人员危害少，标记数量多，可以覆盖整个基因组等特点，且不受季节、组织及环境的限制等特点，在果树的分类研究、基因连锁标记、遗传图谱的构建等方面得到了广泛的应用。初建青等对李RAPD扩增片段进行分析，研究表明，RAPD不仅能扩增基因组上的非蛋白编码序列，而且还可以扩增编码蛋白的基因片段，是能够较全面反映基因组序列信息理想的DNA标记技术。乔玉山等以奉化李为试材，对中国李RAPD反应体系进行了优化，利用该优化反应体系，用10个随机引物，构建了5个中国李品种的RAPD指纹图谱，并以共有谱带率对这些品种遗传关系进行了分析;吉前华利用梯度PCR优化了RAPD反应条件，建立了RAPD-PCR分析的最佳反应体系，显著提高了柑桔RAPD分析的特异性、效率和稳定性。这些表明，RAPD分析是品种鉴定研究的简单实用的方法。
　　文中运用RAPD标记方法对2个李品种基因组总DNA进行了PCR扩增，其RAPD分析条带清晰，用20条随机引物共扩增出114条带，平均每条引物扩增出5.7条条带，扩增片段长度为200～2000bp。20条随机引物中有5条可以单引物区分这2个品种，其中差异条带有6个（表3），表明这6个位点存在差异，可以说RAPD标记是鉴定和区分中国李品种的有效手段，進一步证实了RAPD标记技术鉴定果树品种的可行性。因RAPD每一条扩增谱带对应基因组DNA分子上的一个位点，试验结果说明供试品种间DNA位点差异较多，从分子水平上初步证明这2种李品种在基因组上的差异性，这可能是在栽培过程中未鉴定新品种在栽培过程中发生突变和分化，可能是1个优良种源，这为优良品种选育提供理论支持。
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