蛹虫草人工培养研究进展

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　　摘要：蛹虫草作为冬虫夏草替代品，在传统中药上具有重要的药用价值。近年来，由于过度采挖，导致野生冬虫夏草资源越来越少，而蛹虫草的人工培养已初具规模。该文综述了蛹虫草的菌种选育、人工培养方式、培养基制作、接种技术、培养环境调控、子实体采收、次级代谢产物提取等环节技术的研究进度，并提出了蛹虫草人工培养的发展方向，即：以液体发酵培养实现工业化生产、降低污染率，以及提高次级代谢产物的利用率为重点。
　　关键词：蛹虫草;人工培养;研究进展
　　虫草类药材在中药上具有极高的药用价值，其中冬虫夏草的市场价值最高。近年来，由于人们对冬虫夏草的过度采挖，使其野生资源日渐稀少，市场需求远大于自然生产量。而蛹虫草作为冬虫夏草的替代品，拥有与冬虫夏草相似的药用功效，且已实现人工培养和规模化生产。傅明等以蛹虫草子实体为材料，分离纯化得到3种物质，均具有抗HIV-1蛋白酶活性[1]，且虫草素、虫草多糖等物质对于抗肿瘤、抗HIV具有重要药效，其安全性已被国家批准认可。在人工培养条件下，蛹虫草的虫草素、碳氮化合物的含量等不低于甚至高于冬虫夏草。江晓路等研究认为人工栽培蛹虫草的SOD活性更高[2]。
　　目前，蛹虫草的培养方式主要有活体人工培养、人工固体培养基培养、液体发酵培养3种，技术成熟、推广应用广泛，开辟了蛹虫草新的药材资源。本文通过对蛹虫草的菌种培育、人工培养系列技术及未来研究开发重点等的探讨，为蛹虫草的大规模人工培养提供理论与技术参考。
　　1 菌种选育
　　1.1 菌种选育方法 菌种选育是蛹虫草人工培养的关键技术环节之一。优良菌种的子实体产量，菌种的传代次数，子实体的萌发几率以及虫草素的含量等，都高于劣质种源的。大部分蛹虫草在实际生产过程中都会发生菌种退化现象，即子实体不萌发，菌种不进行生殖生长而回退到营养生长的过程，其中菌核核型的改变是大部分学者认可的菌种退化的内在原因。经相关实验证明：蛹虫草发生生殖生长回退到营养生长的现象，其实质是异核相转变成同核相所致的，异核相具有2个交配型单孢子，同核相只具备1个交配型单孢子，而只有同时拥有2个交配型单孢子子实体才能够正常生长，当蛹虫草异核相转变为同核相就会发生菌种退化现象，子实体不能生长。菌种退化也与菌种传代次数、菌种选育保存条件等诸多因素有关。造成菌核核型改变的可能因素有外部环境、物理因素、化学诱变、以及遗传等。因此，对于菌种的选育，不仅需要考虑环境、种源等外部因素，更要考虑内部遗传因素的影响。
　　目前，较为成熟的菌种选育技术有组织分离、孢子培养以及杂交育种3类。组织分离是选择优良子实体进行悬挂式分离，再接种于PDA培养基鉴别优劣，并制作保存菌种的办法。孢子培养是指从蛹虫草中分离单个孢子并培养成成熟菌丝，从而获得纯菌种的方法。杂交育种是指利用蛹虫草的二极性异宗配合习性，选取优良性状菌种杂交而获得性状优良、遗传稳定的菌种选育方法。3种方法各有优劣，但以组织分离法最为简单有效、成本低，生产上大都选用此法。王艳华等通过对尖头及圆头蛹虫草组织分离和孢子分离选育研究发现，截取上部1.5cm以内的组织块分离出的菌种相对能保证转色出草，越靠近下部的出草率越低或不出草[3]。
　　1.2 表型性状选育菌种技术 良好的表现型性状是菌种选育的目标。袁雪芬从人工栽培的蛹虫草子实体分离得到Az和Bz 2个群体菌株，观察其菌落形态并从中选取部分菌株进行子实体产生实验，结果表明，菌落颜色为杏橙色且气生菌丝较少的菌株经摇培后的菌丝球较小，而且密集，出草率高且产量高[4]。李光荣等通过对野生蛹虫草单孢子进行分离并进行生产子实体试验，观察与测定子实体所含虫草素含量，发现菌落背面颜色呈橙铬色的菌株容易产生子实体[5]。结合上面的方法，可以通过以下2个阶段试验选育优良菌种：第1阶段，固体培养选择菌落颜色深、气生菌丝少的菌种进入第2阶段液体摇培筛选;第2阶段，通过液体揺培，观察菌丝球形态，选择菌丝球细小、密集的菌种用作生产种。同时要注意，菌落颜色呈橙色的菌株容易产生子实体、产量较高。
　　2 蛹虫草人工培养技术
　　2.1 人工培养方式 自1987年梁曼逸等率先以家蚕和柞蚕为寄主培养蛹虫草，获得了与天然蛹虫草相似的子实体[6]，随后柞座蛹、蚕蛹等蛹虫草的人工培养相继成功，至今已出现了3种主要的培养方式：蚕蛹接种培养、人工固体培养、液体发酵培养。3种培养方式所需原料和成本都不一样，产出产物、效率、品质的差异也十分巨大。蚕蛹接种培养是一种以活的蚕蛹为寄主，将虫草菌种注入寄主体内，给予虫草子实体生长适宜的环境条件，最终得到产物，所涉及的蚕蛹选择培育、菌种的保存培养等技术都是极为关键的环节。该方法存在许多不足与限制，如蚕蛹生长具有季节性，不适宜连续生产蛹虫草，注射菌液易污染，成本高、效率低，所得产物量不受控制等。基于此，蛹虫草人工固体培养基培养则克服了以上的缺点，该方法通过添加营养成分，配制蛹虫草所需营养的培养基替代蚕蛹，将虫草菌接种在培养基上培养，国内常用大米、小麦等固体培养基，取得了较好的效果而被广大生产者所接受。液体发酵培养是蛹虫草人工培养领域内拥有广阔前景的培养方式，其菌丝产量高、生长速度快、可连续生产，营养成分及所需产物量都能通过营养元素配比达到合理控制。
　　蛹虫草培养对营养元素配比、空气湿度、光照等条件的要求较为苛刻，蚕蛹接种培养以及人工固体培养受制于培养条件都难以实现机械化操作和规模培养，成本较高、易受环境影响，相比之下液体发酵培养更适合机械操作，受环境影响较小，生产条件安全可控，更适合实现工业化生产，不同培养方式的操作流程差异也较大。
　　蛹虫草人工培养的基本操作流程如下：蚕蛹接种培养，菌种选育→蚕蛹选取→接种培养;人工固体培养，野生或培育种源选取→菌种分离、选育、复壮→试管母种→菌种扩繁→培养基制作灭菌→装瓶（盆或袋）→接种→环境控制→采收;液体发酵培养，制作菌种斜面→摇瓶菌种培養→种子罐扩大培养→液体发酵罐深层发酵→离心分离。 　　2.2 不同培养方式的培养基制作 按照培养方式不同，可将培养基分为液体培养基与固体培养基2种。在人工控制的环境条件下，不同培养基成分对蛹虫草的培养起着至关重要的作用。
　　2.2.1 固体培养基 我国生产者大都选用大米、小麦做原料制作固体培养基，原料简便易得、成本低，培养出来的蛹虫草品质好、虫草素含量高。固体培养基的元素搭配有很多不同的配比，通过不同原料配比所得到的虫草营养素含量与品质也大不相同。
　　张志瑾等以菌种初萌发时间、菌丝长速、菌丝长势、菌丝长满斜面所需时间为指标，筛选出最佳母种培养基配方为：20%马铃薯提取液中加入1%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂、0.5%KH2PO4、0.3%MgSO4、10mg/L VB1，pH值5.8[7]。李春斌等通过对蛹虫草子实体的人工培养研究发现，固体营养物以小米和高粱米的混合物为最佳，最佳碳、氮源为可溶性淀粉和蛋白胨，最佳pH范围是5～6，VB1、2，4-D和无机元素K+、Mg2+、Ca2+对子实体的生长有促进作用[8]。高倩倩等以虫草子座干重为研究指标，发现蛹虫草工厂化生产的最佳培养基配方为90%小麦、10%豆粕，营养液为15g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、1g/L KH2PO4、1g/L MgSO4·7H2O、1g/L VB1、1g/L檸檬酸铵，合适的料液比为1.0∶1.6[9]。
　　2.2.2 液体培养基 液体培养基以各种不同的营养成分搭配，操作更安全可控、空间利用大、生产周期短、效益更高。韦会平等通过对比实验发现，液体菌种栽培比常规栽培发菌时间缩短10d，现蕾出草时间缩短15d左右，且出草整齐，普遍能出2茬子实体，常规栽培的出草往往不整齐，用液体菌种栽培的产量及生物转化率是常规栽培的4倍多，差异极为显著[10]。现多采用液体发酵罐发酵培养，所得产物的虫草素更易提取，省去子实体提取工序。万琴等以虫草素含量为研究指标，发现最佳配方为：23g/L葡萄糖、6g/L酵母浸出粉、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.6g/L KH2PO4、0.01g/L VB1[11]。陈晋安等以菌丝体生长为研究指标，得出最适蛹虫草发酵的液体培养基组分为：50g/L蔗糖、30g/L玉米浆、5g/L酵母膏、0.5g/L MgSO4·7H2 O、0.5g/L KH2PO4[12]。牛帅科等以菌体干重为研究指标，研究认为适合蛹虫草菌的液体发酵最佳培养基为：53.36g/L葡萄糖、26.72g/L蛋白胨、20g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L KH2PO4[13]。范志微以菌丝体生长速度、菌丝体干重和菌落大小为指标进行初筛，以子实体干重、培养周期以及子实体形态、粗多糖含量为指标进行复筛，发现蛹虫草菌株发酵培养基的最优水平组合为：3g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，2g/L MgSO4·7H2O1.5g/LKH2PO4[14]。以上实验表明，对应不同的生产指标要求，蛹虫草液体培养基的成分和含量的差异较大。
　　2.3 不同培养方式的接种技术 接种是蛹虫草人工培养重要的技术环节之一，由于需要在无菌环境下进行，操作必须规范严谨。
　　2.3.1 蛹虫草活体 蛹虫草活体接种的方式多种多样，安秀荣等比较研究了以下方法：（1）对活体虫蛹进行液体菌种注射;（2）先将活体蛹扎孔放人广口瓶，再倒入10mL液体菌种;（3）倒入10mL液体菌种至广口瓶，再将活体蛹直接放入;（4）将已经培养成熟的子座接入活体蛹的体腔内;（5）将活体蛹扎孔后放人子座已长好的培养基上，使其自然感菌;（6）将活体蛹扎孔后放入已发满菌丝的培养基上;（7）将斜面菌种接入活体虫蛹体腔内。结果发现，菌液注射0.2～0.5mL入活体蛹的体腔内，出草较多，因菌丝侵入虫体内部，利用虫体内部营养，所形成的子实体健壮，商品率高。所以在生产中采用活体注射入体腔的方式最好[15]。
　　2.3.2 蛹虫草人工固体培养 接种过程必须保证无杂菌污染，接种时根据环境条件和设施，选择适宜的无菌接种方式。将注射器等接种器具放入沸水或高压蒸汽灭菌锅中灭菌20～30min，培养基提前进行高压灭菌，温度达124℃时保持1.5h左右，灭菌结束后锅内，待温度达60℃左右时取出培养基，冷却凝固后接种。严格按照无菌接种操作将菌种用无菌水稀释倒入无菌瓶，在超净工作台上用注射器吸取菌液，在酒精火焰灯附近戳破无菌膜接种在固体培养基上。晃动固体培养基，使菌液均匀遍布培养基表面，接入菌量不宜过少，放置于培养架上进行培养。
　　2.3.3 蛹虫草液体发酵培养 提前将蛹虫草菌接种于改良PDA培养基，在（21±1）℃光照环境下活化培养，待菌株蔓延至培养基边缘时，保存于冰箱备用。在无菌接种间，于超净工作台上将活化的菌丝接种于已灭菌的改良PDA液体培养基，放于摇柜170r/min、（21±1）℃摇培4～5d，获得少量种菌悬液，然后接种于液体发酵培养基，接种量在10%～15%，注入发酵罐进行分批发酵，罐压0.05～0.07MPa，通风量为1∶0.05（V/V·min），搅拌速率200r/min较为适宜。
　　2.4 子实体培养及环境调控 子实体由蛹虫草真菌生殖菌丝生长而成，顶端膨大呈棒状，是蛹虫草人工培养的最终产物，一般子实体生长至橘红色便代表已经成熟可以采收。影响子实体生长的因素包括温度、光照、湿度、昼夜温差、空气成分、碳氮比等。生产上一般将栽培瓶放置在培养架上培养，温度控制在22～25℃避光培养。菌丝长满瓶进入原基形成阶段，此阶段每天要保持12h左右光照，若光线不足可用日光灯替代，空气湿度保持在65%～70%、温度18～22℃、昼夜温差3～5℃、光照强度100lx左右适宜原基分化，大约5d左右菌丝由白色转变为橘黄色形成子实体，原基分化完成后子实体已成型进入子实体培养阶段。蛹虫草属于低温菌类，子实体与子座对生长温度有着很高的敏感度，光照对人工培养子实体有效成分虫草素、虫草多糖等的合成具有重要影响，子座最适宜生长温度为18～22℃，如果低于或高于这个温度范围，生长减慢，高于30℃会很快死亡，子实体生长适宜温度为18～22℃，超过25℃则难以形成。王菊风认为，蛹虫草生长发育的适宜温度是17～25℃，子实体生长的最适温度是22℃[16]，强光有利于虫草多糖、胡萝卜素等的提高，弱光有利于子实体产量、虫草素等的提高，延长光照时间则有利于原基形成。子实体培养期间应将光照时间缩短至自然长度，保证白天有充足的散射光，晚上不补光，每天转动不同瓶面以确保子实体受光均匀，大约15d即可采收第一批子实体。张金艳经过综合研究认为，蛹虫草培养适宜的光照条件为：白炽光、光照强度为200lx，每天光照时间分阶段设置，原基形成阶段24h/d、子实体生长阶段16 h/d为最佳[17]。高晓梅等通过光质和光强对蛹虫草子实体形成、生长的影响试验认为光强：50～100lx弱光对原基分化、子实体诱导有促进作用，1000lx条件下子实体生长较好，橙黄光条件下子实体的质量和产量都有所提高[18]。综上所述认为，子实体培养过程中的光照、温度、空气湿度是重点控制的3个要素，温度保持在22℃左右、光照强度1000 lx左右、空气湿度在65%～70%，适宜于蛹虫草子实体的培养。 　　2.5 子实体采收及次级代谢产物虫草素等的提取
　　2.5.1 子实体采收 在经过严格控制的环境条件下培养15d左右，子实体表面长度达到6～7cm，子囊膨大成熟，便可以采收第1批子实体。用工具小心将子实体基部采下，除去表面杂质和多余的水分。继续培养一个周期可以收获第2批子实体。将所采收的子实体用40～45℃烘干器烘干至含水量≤12%，分批保存。人工培养的蛹虫草包含虫草素、虫草多糖等多种稀有营养元素，营养价值极高，若将其中营养物质提取出来并作药用，或加工或开发保健品，将大幅度提高其附加值。
　　2.5.2 次级代谢产物虫草素等的提取 虽然从子实体中提取所得虫草素含量最多，但在实际生产过程中，为使经济效益最大化，蛹虫草的培养基残渣中的虫草素、虫草多糖等有较大经济价值的次级代谢产物也不容忽视，并且从副产物中提取也比从子实体中提取的成本更低、效益更高。因此，研究如何从培养基残渣中提取虫草素等成为了行业研究的热点。韦会平等通过连续逆流提取、732阳离子交换树脂柱层析和结晶3步法，对每一步的工艺参数进行了系统优化，用该优化的方法从大米培养基中提取虫草素，产品的纯度达98.0%以上，产率达66.0%以上[19]。车振明通过对蛹虫草子实体及培养基的粉碎，采用石油醚脱脂、80～85℃水浴12h、调节等电点沉淀、732-NH4离子交换树脂的分离和浓缩、4℃下低温结晶方法，得到纯度达81%的虫草素晶体[20]。孙诗清从优化的虫草素和虫草多糖生产工艺出发，研究出同时提取虫草素和虫草多糖的工艺方法，同时，分别采用高效液相和苯酚-硫酸法对虫草素和虫草多糖进行含量测定，确定不同纯化方法所得虫草素虫草多糖的含量差异，进一步确定分别使用阴离子树脂和DEAE纤维素为最好的纯化方法[21]。麻兵继等用石油醚脱脂，残渣干燥后以热乙醇提取得浸膏，浸膏转水溶后调节等电点，再用活性炭脱色，脱色后的溶液最后过732阳离子交换树脂以NH3·H2O洗脱液洗脱，得到虫草素纯度约为80%，总得率约为1‰[22]。综合上述研究，我们可以得出其基本的分离提取步骤：先用石油醚脱脂，再用离子交换树脂进行初步分离，由于虫草素呈弱碱性，所以应该选用强酸性阳离子树脂进行分离，最后经过浓缩，在低温下结晶，便可得到纯度较高的虫草素结晶产物。
　　3 展望
　　目前，蛹虫草人工培养虽能规模化生产，但仍存在一些问题，如菌种退化、次级代谢产物（残留虫草素培养基）利用率低等。（1）蛹虫草人工培养普遍存在菌种退化的问题，即培养一定周期后蛹虫草菌子实体不再生长，或生长不全。菌种退化最容易出现在大规模培养基固体培养，液体发酵培养等批次培养过程中。夏凤娜等研究了蛹虫草在5种保藏条件下菌丝活化的情况以及菌丝活化后的深层培养和固体培养长势等发现，蛹虫草最佳保藏温度为（4±2）℃[23]，温度可以影响菌种退化率，汪虹等对收集到的14株蛹虫草正常菌株和退化菌种进行PCR鉴定发现，3株正常菌株为异核体，11株退化菌株仅仅含有MAT-HMG或者MAT-alpha交配型基因，判定为同核体[24]，通过预防核相改变防止菌种退化是解决问题的根本，在实际生产中可以采用减少传代次数，改善培养基营养配比，优化菌种种源的保存环境、调节pH，及时复壮选育优质种源等方式降低菌种退化。（2）我国蛹虫草人工固体培养过程中的残余物质虫草素等的提取工艺还并不完善，次级代谢产物利用率极低。因此，未来需要大力提升蛹虫草次级代谢产物的提取工艺水平、降低提取成本，提高提取效率。
　　当前，我国的蛹虫草人工培养仍以固体培养或蚕蛹活体培养为主要方式，然而蚕蛹或固体培养都存在成本高、经济效益低等问题，在培养过程中对无菌以及生长环境要求苛刻，需要严格控制空气温度和空气湿度，耗费大量的人力物力，虫草素的提取成本高、效率低。活体人工培养一般在春季4—7月培养，受生物虫体因素影响大。液体发酵培养的菌丝生长快、周期短、条件安全可控，污染较前2种方式更低，可通过发酵罐连续发酵，虫草素等营养物质提取方便，能适应工业化连续生产。因此，未来蛹虫草人工培养将以液体发酵培养为主要发展方向，逐步实现蛹虫草的工业化、规范化生产。
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