转TaCOMT-3D基因小麦的农艺性状评价

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　　摘要 TaCOMT-3D基因是小麦木质素合成的关键基因，也是小麦抵御纹枯病菌侵染的重要基因。为了评估转基因小麦中TaCOMT-3D基因组成型表达对农艺性状的影响，4个遗传稳定的转基因株系及其受体对照扬麦16用于TaCOMT-3D基因检测、不同器官表达分析验证、纹枯病抗性鉴定、小区产量试验以及主要农艺性状的考察。结果显示，转基因株系均能检测到导入的TaCOMT-3D基因并且该基因能组成型表达;转基因株系与受体对照扬麦16相比，纹枯病抗性显著提高;除了部分转基因株系的主穗穗长、主穗粒数、籽粒蛋白含量与受体对照差异显著外，转基因小麦的生育期、、株高、产量性状、主穗性状和籽粒性状与受体对照均没有显著差异。试验结果表明，TaCOMT-3D基因的组成型表达对转基因小麦的主要农艺性状影响不明显。
　　关键词 小麦;TaCOMT-3D;转基因;纹枯病;农艺性状
　　中图分类号 S 503.2文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）01-0102-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.032
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Evaluation of Agronomic Traits of Transgenic Wheat with TaCOMT-3D
　　ZHOU Miao ping1，ZHANG Zeng yan2，YAO Jin bao1 et al
　　（1.Institute of Grain Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;2.Institute of Crop Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
　　Abstract TaCOMT 3D gene is a key gene in wheat lignin synthesis and is also an important gene resistant to wheat sharp eyespot.To assess the effect on agronomic traits of the transgenic wheat by TaCOMT 3D，four varieties with stable heredity and their receptor Yangmai 16 were used to detect the TaCOMT 3D ，analyze the expression of the gene in different organs，evaluate the resistance to wheat sharp eyespot，test plot yield and survey the major agronomic traits.The results showed that the TaCOMT 3D gene could be detected in all transgenic lines and expressed constitutively in different organs.Compared with Yangmai 16，the resistance to wheat sharp eyespot improved significantly in all transgenic lines.There were no significant differences in wheat growth period，plant height，yield traits，main spike traits and grain traits except for significant differences in grain protein content，ear length and number of grains of main spike between some transgenic lines and receptor control.The results indicated that the constitutive expression of TaCOMT 3D had no significant effect on the main agronomic traits of transgenic wheat.
　　Key words Wheat; TaCOMT 3D;Transgene;Wheat sharp eyespot;Agronomic trait
　　小麥纹枯病是我国长江中下游麦区和黄淮麦区的重要病害，每年造成经济损失巨大[1]，该病害主要由禾谷丝核菌等侵染小麦茎秆基部引起，抗病小麦的培育和推广是防治该病害、保证小麦可持续发展的重要措施。由于小麦对纹枯病的抗性是数量性状，抗性涉及多个QTL位点和多条染色体[2]，抗性QTL的累积耗时费力，因而小麦抗纹枯病育种进展缓慢。
　　转基因技术可以引进外源的抗病基因或者对小麦本身的基因进行修饰，从而提高小麦的纹枯病抗性，已经成为小麦纹枯病抗病新种质创制的重要途径[3-5]。中国农业科学院作物科学研究所张增艳实验室对纹枯病抗感小麦品种CI12633（抗）和温麦6号（感）采用基因芯片分析技术发现并克隆了位于3DL染色体的差异表达基因TaCOMT-3D，过表达和抑制表达试验表明该基因是小麦抗纹枯病的重要基因，进一步的研究发现该基因的过表达增加了小麦茎秆中的木质素积累，提高了茎秆强度，增强了对小麦纹枯病菌的抵御能力[6]。将由ubiquitin组成型启动子驱动的TaCOMT-3D基因导入小麦品种扬麦16中，发现其纹枯病抗性较受体对照明显提高。但该基因的组成型表达对小麦其他农艺性状有何影响尚不明了。该研究拟对筛选获得的4个遗传稳定的转基因株系在大田环境下与受体对照扬麦16的农艺性状进行比较，评价TaCOMT-3D基因的组成型表达对转基因株系重要农艺性状的影响。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料 转TaCOMT-3D基因株系CT248、CT274、CT323和CT345由中国农业科学院作物科学研究所张增艳研究员提供;受体对照扬麦16由江苏省农业科学院粮食作物研究所麦类作物研究室提供。
　　1.2 方法
　　1.2.1 转基因株系TaCOMT-3D基因的检测。
　　分别取转基因株系和对照扬麦16的幼苗叶片，冷冻干燥，全自动样品快速研磨仪（上海净信）磨碎后参照Karroten植物基因组DNA提取试剂盒操作手册提取DNA。导入的TaCOMT-3D基因采用嵌合引物进行扩增，正向引物序列为TaOMT-3D-964JCF：5′—GAGAGGTACGAGAGGGAGTT—3′，反向引物序列为TaOMT-3D-1281JCR：5′—TAAATGTATAATTGCGGGAC—3′;PCR反应体系总体积为20 μL，含2× premix Taq （TaKaRa）10 μL，5 μmol/L 引物各 1 μL，50 ng 模板DNA。 PCR扩增条件为94 ℃ 预变性5 min;94 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物300 bp左右，PCR产物采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离。
　　1.2.2 转基因株系TaCOMT-3D基因的表达分析。
　　灌浆期，取转基因株系和对照的根、茎、叶和籽粒，液氮冷冻磨碎，采用植物RNA快速提取试剂盒（南京钟鼎）提取RNA，Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）进行反转录，按照SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa）推荐方法进行荧光定量PCR。Actin基因为内参基因，其特异引物对为TaActin-F： 5′—CACTGGAATGGTCAAGGCTG—3′和TaActin-R：5′—CTCCATGTCATCCCAGTTG—3′; TaCOMT-3D基因特异引物对为TaCOMT-Q-F：5′—ATGTTCCAGAAGGTGCCC—3′和TaCOMT-Q-R：5′— TGCTCG TCGCTCCAGTC—3′。 荧光定量PCR在LineGene K 荧光定量PCR仪（杭州博日）上进行，扩增曲线：95 ℃ 30 s，循环1次;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环40次，72 ℃单点检测信号。溶解曲线：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，连续检测信号[7]。采用2-△△Ct法对数据进行相对定量分析。
　　1.2.3 转基因株系的农艺性状观察和分析。
　　转基因株系和受体对照于2018年12月17日在江苏省农业科学院六合转基因基地按随机小区播种，每个小区5行，行长2 m，行距0.25 m，3次重复。播种后覆盖地膜至2019年1月15日，其余按正常小麦种植管理。
　　田间试验主要对转基因株系的生长发育和形态特征等主要农艺性状进行观察，记载播种、出苗、抽穗、开花和成熟等各生育时期;调查和测量基本苗、高峰苗、有效穗、产量、株高等重要农艺性状;成熟时，考察主穗穗长、小穗数、不孕小穗数以及每穗粒数;收获后，测量籽粒大小、千粒重和籽粒蛋白含量等籽粒性状;同时调查转基因株系对白粉病、纹枯病和赤霉病等病害的抗性。
　　籽粒大小测量方法：每小区随机取100粒籽粒，照相后采用SmartGrain软件[8]根据像素计算籽粒长度与宽度;籽粒蛋白含量采用Perten DA7200近紅外仪测定。
　　所有数据的方差分析和t测验分析均采用Excel 2016软件进行，先进行方差分析，差异显著的性状再分别在各转基因株系和受体对照间进行t测验。
　　2 结果与分析
　　2.1 转基因株系TaCOMT-3D基因的检测结果
　　种植的4个转基因株系经T3检测已经纯合，该试验已达T4代，拔节期分别取转基因株系和受体对照扬麦16的叶片，提取DNA。考虑到小麦本身含有TaCOMT-3D基因，因而采用嵌合引物检测导入的TaCOMT-3D基因，嵌合引物的正向引物在TaCOMT-3D中，反向引物在nos终止子中，结果表明转基因株系均能扩增出300 bp的目的条带（图1），而受体对照未有扩增条带出现，表明导入的TaCOMT-3D基因已经整合进小麦基因组并能稳定遗传。
　　2.2 转基因株系TaCOMT-3D基因的表达分析结果
　　灌浆期分别取转基因株系和受体对照的根、茎、叶片和籽粒样品，提取RNA并反转录成cDNA，采用荧光定量PCR检测TaCOMT-3D基因的表达，以受体对照扬麦16各器官的表达为基准，计算转基因株系不同器官的相对表达量，发现4个转基因株系的根、茎、叶片和籽粒等器官中TaCOMT-3D基因的表达均超过受体对照扬麦16，符合组成型表达的预期。
　　2.3 转基因株系的农艺性状表现
　　2.3.1 生育期的比较。由于播种已经迟于扬麦16最适播种期，采用加大播种量和覆盖地膜等措施，保证小麦齐苗和足苗。小麦返青后，加强肥水管理，小麦生长基本正常，转基因株系生育期与受体亲本扬麦16相仿（表1），表明目的基因的导入和持续表达对其生育期影响不明显。
　　2.3.2 苗情和产量的比较。4个转基因株系与扬麦16相似，均属春性小麦，幼苗半直立，后期株型较松散。由于播种气温偏低，尽管采取加大播种量和地膜覆盖措施，但是基本苗仍偏低，转基因株系与对照没有明显差别，表明目的基因的导入和表达对种子萌发没有显著影响。
　　在基本苗基本一致的情况下，转基因株系的高峰苗和有效穗与对照差异不显著，说明目的基因的表达没有对小麦的繁茂性和成穗率产生明显影响。除了转基因株系CT323较扬麦16增产外，其余3个转基因株系的产量低于扬麦16，但都未达到显著差异水平。由于播种期的推迟，生育期缩短，转基因株系和对照的株高均有所降低，但转基因株系与对照株高相差不明显（表2）。 　　2.3.3 主穗性状的比较。
　　灌浆后期，对转基因株系和对照的主穗农艺性状进行考察，结果见表3，除了CT274的主穗粒数、CT345的主穗长度和主穗粒数与对照相比有显著差异外，其余转基因株系主穗性状与对照扬麦16相比无显著差异。
　　2.3.4 籽粒性状的比较。籽粒收获晒干后，每小区随机取100粒测定籽粒长度和宽度，计算平均值，方差分析显示尽管转基因株系和对照的籽粒长宽有所变化，但差异均不显著。采用近红外测定籽粒蛋白含量发现转基因株系籽粒蛋白含量均较对照有所提高，CT274和CT345与对照的差异达到显著水平。转基因株系的千粒重与对照差异不显著（表4）。
　　2.4 病害抗性的比较
　　由于2018—2019年度小麦生长期雨水偏少，田间湿度低，并且试验地已经多年未种植小麦，与常规小麦的物理距离也超过500 m，小麦病害的病原菌较少，因而转基因株系和对照扬麦16的白粉病、锈病、纹枯病、赤霉病、小麦黄花叶病等主要病害均未发生或轻微发生，转基因株系与受体对照差异不明显。但在人工病麦粒接种条件下，转基因株系与对照纹枯病病害差异仍然明显（表5），转基因株系较受体对照平均病情指数降低18.6%～34.6%。
　　3 讨论与结论
　　木质素是细胞次生壁的主要成分，在植物体内的含量仅次于纤维素，对维管植物的生长发育是必需的，它参与了细胞壁木质化，加大了细胞壁的抗压强度，促进了机械组织的形成，对植物的抗倒伏和抗病有重要影响。研究发现木质素由木质素单体聚合而成，根据单体来源的不同可将木质素分为H型木质素、G型木质素和S型木质素3种类型，单子叶植物均含有这3种木质素。
　　咖啡酸3-O-甲基转移酶基因（COMT）是植物木质素合成的重要基因，COMT可以催化咖啡酸、5-羟基松柏醛、5-羟基松柏醇甲基，分别形成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，从而调控S型木质素的合成[9]。研究发现，S型木质素含量与拟南芥对核盘菌和维管束真菌甘蓝轮枝菌的感病性有关[10]。玉米中研究也发现，ZmCCoAOMT2可以调节木质素含量以及改变次生代谢途径调节细胞的死亡程序从而提高对玉米小斑病和灰色叶斑病的抗性[11]。但将这些基因导入植物中组成型表达对植物其他性状影响的研究几乎没有报道。
　　中国农业科学院作物科学研究所张增艳课题组将组成型表达的TaCOMT-3D基因导入小麦可以提高茎秆木质素含量，增强小麦茎秆强度，提高对纹枯病菌侵染的抵御能力。笔者引进纯合的转基因株系与受体对照在大田生长状况下评估组成型表达的TaCOMT-3D基因对小麦其他农艺性状的影响，结果表明只有个别转基因株系在主穗穗长、主穗粒数和籽粒蛋白含量方面与受体对照的差异达0.05显著水平，但该基因对冬春性、生育期、产量和株高等重要农艺性状没有产生显著影响。
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