基于微液滴的Zn0纳米结构制备及荧光检测性能研究

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　　摘要：基于液滴微反应器，通过水热法合成Zn0纳米结构.该芯片集成了多种功能单元，包括用于液滴生成的T形通道，液滴汇合的Y形通道，以及快速混合和观察纳米结构形成的S形通道.通过调节水相和油相的流量改变液滴的尺寸，研究微液滴中制备的纳米结构的形貌和尺寸，并利用硫氰酸荧光素标记的羊抗牛IgG研究其荧光检测性能.该工作表明，通过流体动力学耦合形成的微液滴可制备Zn0纳米结构，其颗粒形貌和尺寸随着液滴尺寸的变化而改变.加热温度为75℃，油相、氨水、锌盐溶液流量分别为600、30、90 μL/h时制备的Zn0纳米结构具有最优的荧光检测性能.
　　关键词：微流控芯片;液滴;Zn0纳米结构;荧光检测
　　中图分类号：0611
　　文献标志码：A
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.201933001
　　0 引言
　　在过去几十年里，无机、有机、聚合物和复合纳米材料由于其独特的性能，被广泛应用于各个领域[1-4].其中，无机纳米材料具有独特的光学[5]、磁学[6]、热学[7]和电学性能[8]，可通过生物功能化让其具有良好的生物相容性[9]，在可控药物输送，实时、超灵敏的诊断以及高通量治疗等方面表现出显著的优势[10-12].随着医疗领域进入个性化时代，利用纳米材料进行生物检测将会得到巨大的发展∽在这些结构中，氧化锌（Zn0）是一种带隙宽（3.4 eV）和激子结合能大（60 meV）的半导体化合物，具有良好的生物相容性以及化学稳定性，成为了近些年荧光检测的研究热点[13-14].由于材料的性能与其尺寸和形貌高度相关，改变合成条件将会影响其形貌、尺寸进而提高性能[15-16].因此，探索新的合成方法，高效地筛选合成条件，进一步优化纳米结构的性能成为研究的热点[17].
　　Zn0納米结构的制备常采用批量水热合成法，该方法的反应器比较大，传热传质的效率比较低，局部的反应条件有差异，快速优化合成条件以及精确地控制反应条件较困难.近年来微液滴技术作为一种新兴的纳米结构的制备方法和研究化学反应的有力工具，受到越来越多的关注[18-20]，该技术具有高通量、体积小、比表面积大、传热传质快、精确控制液滴中的化学反应以及防止液滴间的相互干扰等优点[21-23]，有利于形成高质量的纳米结构，简化研究和分析[24].目前已经利用该技术合成了金属，金属氧化物和半导体量子点（量子点）[25]等材料.
　　为了高效地探究Zn0纳米结构的合成条件以及优化合成条件，本文利用双T形结构的微流控芯片产生微液滴，并在液滴中合成了Zn0纳米结构[26].首先探究了油相和水相的流量对液滴大小的影响，然后研究了两种分散相的流速比对Zn0纳米结构的形貌、尺寸的影响，并利用硫氰酸荧光素标记的羊抗牛IgG研究Zn0纳米结构的生物荧光检测性能.
　　1 实验方法
　　1.1 试剂与仪器
　　六水硝酸锌（Zn（N03）2·6H20）、氨水（NH3.H20）、无水乙醇（C2H60）、丙酮（C3H60）、异丙醇（C3H80）、司班80（C24H4406），均由国药集团化学试剂有限公司生产，聚二甲基硅氧烷（PDMS）由美国Momentive公司提供，矿物油（MO）、氯三甲基硅烷（C3H9CISi）购于Sigma公司，二甲基硅油（[OSi（CH3）2]n）上海森灏精细化工有限公司生产，异硫氰酸荧光素标记的羊抗牛IgG（FITC-antibovine IgG）、磷酸盐缓冲液（PBS）购于美国ImmunoReagents公司.
　　1.2 微流控芯片的设计与制备
　　本文设计了如图1所示的微流控芯片.芯片铸件由含有（11：2，wt）硅油的PDMS制成，具有多功能的通道而且通道表面具有一定的疏水性.两个T形通道用于产生液滴，S形通道用于液滴的融合和混合.微流控芯片通过标准软光刻工艺制备，首先将50 μm厚的SU-8光刻胶（MicroChem）旋涂到硅衬底上，在紫外灯下曝光和显影之后，将三甲基氯硅烷作为脱模剂蒸发在模具上.然后将基础聚合物、交联剂、硅油以10：1：2（w/w/w）的比例制备PDMS预聚物，并倒人SU-8模具中，并将样品置于真空室中以排出气泡.最后，在80℃下固化4h后，剥离PDMS铸件.另一方面，分别用丙酮、异丙醇和超纯水清洗玻璃基板，将玻璃基板用氮气干燥并置于80℃的烘箱中2h.为了进一步增强疏水性，将含有饱和硅油的PDMS（10：1：5，w/w/w）以2 000 r/min旋涂在载玻片上30 s，再将其置于90℃的热板上，加热5 min.在旋涂之前，使用PDG-32G等离子体清洗机（Harrick）用氧等离子体处理玻璃面2 min.最后将PDMS铸件和旋涂了PDMS的载玻片在氧等离子体清洗机中进行表面处理并键合，形成宽度为300μm、高度为50μm的微通道.
　　1.3 液滴的产生与融合
　　利用双T形微流控芯片进行液滴的产生和融合，为了探究两相流体流量对液滴形成和融合的影响，使用含有0.5% （wt）Span 80的矿物油作为油相（连续相），含有粉色和蓝色色素的去离子水作为水相（分散相）[27].利用兰格注射泵将油相和水相引入微流控芯片中，使油相和水相的流量分别在300～700 μL/h以及20～500 μL/h的范围变化.
　　1.4 Zn0纳米结构的制备
　　采用微液滴技术制备纳米结构，每个融合的液滴都是用于合成的独立微反应器.改变油相与水相的流量，形成不同尺寸的液滴，并在液滴中制备Zn0纳米结构.实验流程如图2所示，一侧T形通道处生成含有0.05 mol/L的Zri（N03）2·6H20的液滴，另一侧T形通道处生成含有1% （wt）氨水的液滴，两个液滴在Y形通道处相遇，包裹水相液滴的油相层开始变薄，直到两个液滴融合[281这两个液滴融合时立即发生化学反应，产生Zn0纳米结构.为了很好地控制合成过程，控制合成加热的温度为75℃，油相流量保持为600 μL/h，氨水流量保持为30 μL/h，调节锌盐溶液流量从30 μL/h变化到150 μL/h，获得氨水与锌盐溶液的不同流量比（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5）.最后，离心管收集样品2h，用无水乙醇（8 000 r/min）离心洗涤3次，并在80℃的烘箱中干燥24 h. 　　1.5 Zn0纳米结构的荧光检测
　　将异硫氰酸荧光素标记的羊抗牛（FITC-anti bovine IgG）溶解在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，得到1μg/mL的蛋白溶液.然后把不同条件下制备的Zn0纳米结构利用超声机超声5 min，让其分散在400 μL的无水乙醇中，再从中取出200 μL的液体滴人5 mm口径的PDMS储液池中.最后让蛋白溶液在储液池中孵育30 min，将蛋白溶液吸出，再用PBS和去离子水清洗3遍，得到不同条件下Zn0纳米结构为载体的荧光蛋白样品f见图3），置于荧光显微镜上观察.
　　1.6 表征
　　利用微液滴技术在不同条件下制备Zn0纳米结构，并且利用扫描电子显微镜（SEM）和X射线衍射（XRD Rigaku，Ultima IV）分别对Zn0纳米结构的形貌和晶体结构进行表征.通过具有CCD的显微镜（BDS200-FL，Optec Instrument）获得液滴产生、融合以及Zn0纳米结构合成过程的图像.样品的荧光的强度用荧光显微镜（重庆奥特BDS200-FL）进行检测.
　　2 结果与讨论
　　2.1 流速对液滴尺寸和液滴融合的影响
　　研究了不同油相流量条件下两个液滴的产生及融合过程.在该实验中，连续相是含有0.5%（wt）Span 80表面活性剂的矿物油，为了区分两个水相以及观察两个液滴融合后快速混合过程，让一侧T形口处产生含有蓝色素的液滴（深色的液滴），另一侧T形口处产生含有粉红色素的液滴（浅色的液滴）.保持水相的流量（20 μL/h）恒定，并将油相的流量从300μL/h增加到700 μL/h.从图4中可以看出，其液滴尺寸随着油相流量的减小而增加，并且融合的液滴逐渐变大.
　　在液滴混合过程中，两个含有不同色素的液滴融合在一起后，其内部将以行进方向为对称轴，产生两个环形对流混合的旋涡.同时，由于受到S形结构的影响，液滴不断受到拉伸和折叠，从而产生了混沌对流效应[29]，因此在S通道中，融合后的液滴具有更高的混合效率，可以在0.7 s内完成混合，有效地促进了每个液滴中的化学反应，让其变成独立、高效的微反应器.
　　进一步探究不同流量条件下液滴的尺寸变化情况f见图5），可以發现水相流量不变、油相流量增加时，液滴尺寸随之增小[28]，油相流量保持不变，逐渐增大水相流量，液滴的尺寸也会增大，但是水相流量过大就无法产生稳定的液滴.这种近似的线性变化是由于矿物油和水相溶液之间的不相容性，当它们在T形接头处接触时，之间会形成油/水界面.一旦水相溶液承受矿物油对它的剪切力大于油/水界面处的界面张力时，水相溶液就会破裂以产生被油相包围的单独的液滴.因此液滴的大小取决于油相与水相的流量、流体粘度以及T形接头处的微通道尺寸[28].
　　2.2 不同流量比对Zn0纳米结构形貌的影响
　　利用如图1所示的微流控芯片合成Zn0纳米结构，通过调节氨水与锌盐溶液的流量比来研究Zn0纳米结构的形貌、尺寸的变化.两个液滴相遇融合即发生反应，生成Zn0纳米结构，其生长机理[30]如下所示：
　　氨水作为碱性试剂，提供了一个稳定的pH值，然后和2n2+发生一系列反应生成Zn0沉淀.其中通过调节氨水与锌盐溶液的流量比，改变了融合后的液滴体积，同时也改变了液滴中的pH值和锌盐的浓度.
　　如图6所示，探究了不同流量比对Zn0纳米结构的形貌及尺寸的影响.油相流量为600 μL/h，氨水的流量为30 μL/h，氨水与锌盐溶液的流量比从1：1逐渐减少至1：5.结果表明，随着流量比的减小，Zn0纳米结构的尺寸也发生了变化.保持氨水与锌盐溶液的流量的比例为1：1时，Zn0纳米结构的形貌为均匀分散的球形颗粒.图6（g）所示，继续减小氨水与锌盐溶液的流量的比例（1：2），大部分为均匀分散的球形颗粒，少部分球形颗粒融合.当流量比为1：3时，Zn0纳米结构形貌变为多面体结构;流量比为1：4时，Zn0纳米结构的形貌主要为多面体结构，还有少量的片状结构.氨水与锌盐溶液的流量比减小为1：5时，Zn0纳米结构的形貌主要为片状结构.
　　如图7所示，进一步探究Zn0纳米结构尺寸变化，随着氨水与锌盐溶液的流量比减小，颗粒尺寸先逐渐变大再减小，当流量比为1：4时，此时的Zn0纳米结构尺寸最大.在流量比较小时，合成的Zn0纳米颗粒具有较小的尺寸以及较高的一致性和重复性，而流量比较大时，合成的Zn0纳米结构尺寸较大，但其尺寸不够均一，分布较广.
　　此外，图8（a） （b）为氨水与锌盐溶液的流量比为1：3的条件下，合成Zn0纳米结构的EDS和XRD图谱.其中的衍射峰31.767°，34.421°，36.252°，47.538°，56.592°，62.856°，66.372°，69.083°，72.566°，76.956°对应于Zn0纳米结构的六方纤锌矿结构中（100），（002），（101），（102），（110），（103），（200），（112），（201），（004），（202）的各个晶面.根据图8（b） EDS的图谱显示，Zn0纳米结构2ri2+和02的原子比例相同，说明了具有良好的品格结构.
　　之前的工作阐明Zn0纳米结构的形貌和尺寸是受到液滴中的试剂浓度和pH值的影响，表明Zn0纳米结构的形貌和尺寸随着试剂浓度的变化而变化[30-31]。在本文工作中，锌盐溶液的液滴尺寸逐渐增加，而氨水的液滴尺寸保持恒定，导致融合的液滴中2ri2+的浓度逐渐增加，形成更多的络合物[31]NH3.H20分解为NH4+和OH，主要作用有两个方面，一方面调节溶液的pH值，和2ri2+形成络合物，另一方面同时NH4+会吸附在Zn0晶核的表面，影响Zn0的生长[32].根据液滴大小和试剂初始浓度估算pH值，氨水的初始pH值为11.5，随着流量比的降低，pH值逐渐从11.5降至11.当氨水与锌盐溶液的流量比为1：1和1：2时，液滴中溶液的pH值为11.3左右，2n2+含量较低，生长较为缓慢，得到类似于球形的纳米结构.当流量比为1：3时，pH略有减小，而2ri2+的含量增加，络合物的浓度随之增大，有利于Zn0纳米结构的快速生长，形成多面体结构[31]，随着流量比的继续减小，液滴中氨水pH值将会降低到11，Z n2+络合物的浓度进一步增加，晶体的生长速度更快，聚集形成片状结构.显然，每一个液滴构成了独立的微反应器，可以快速的对反应条件进行响应，制备得到不同形貌的Zn0纳米结构. 　　2.3 基于Zn0納米结构的生物荧光检测的应用
　　以FITC-anti bovine IgG为模形分子，研究不同形貌的Zn0纳米结构的检测性能.由于Zn0纳米结构具有较高的等电点，在中性缓冲液中，Zn0纳米结构的表面具有正电荷，而荧光蛋白分子具有较低的等电点，表面具有负电荷，它们之间可以发生静电吸附，因此Zn0纳米结构可作为荧光检测的基底[33]，如图9所示，不同形貌的Zn0纳米结构检测浓度为1μg/mL的IgG FITC-anti bovine IgG蛋白溶液所得到的荧光照片和强度曲线分布图.
　　从图9（g）可以看出，随着氨水与锌盐溶滚的流量比逐渐减小，检测荧光强度逐渐增加.当流量比达到1：3之后，荧光强度随着流量比的减小而减小，其中流量比为1：3时，荧光强度最高，达到了149.这是由于Zn0纳米结构的形貌会影响荧光蛋白的检测，Zn0纳米结构具有的表面积越大，提供的蛋白吸附位点越多，进而荧光强度也就越高.流量比为1：1和1：2时，Zn0纳米颗粒较少，蛋白吸附的表面积相对较小，导致荧光强度不高.流量比为1：3时，Zn0纳米结构的形貌为多面体结构，所提供蛋白吸附的表面积相对较大，吸附的荧光蛋白也更多，荧光强度得以增强.流量比为1：4和1：5时，虽然此时Zn0的尺寸较大，但Zn0纳米结构主要形貌趋于堆叠的片状结构，表面积减小，可吸附的蛋白也随之减小.因此，液滴微反应器中，由于pH值、试剂浓度和快速混合效率的综合影响，氨水与锌盐溶液的流量比为1：3是最佳的合成条件.
　　3 结论
　　本文利用微液滴技术制备了Zn0纳米结构，研究了不同合成条件下对Zn0纳米结构形貌的影响，并且利用Zn0纳米结构为载体对蛋白进行了检测.实验结果表明，改变氨水与锌盐溶液的流量比能够有效地控制Zn0纳米结构的形貌.与常规方法相比，微液滴技术提高了合成过程中反应物的混合效率，减小了混合时间以及试剂消耗，而且可以更高效地控制Zn0纳米结构的形貌，快速地筛选合成条件.本研究表明在氨水与锌盐溶液的流量比为1：3时，Zn0纳米结构的形貌为多面体结构，具有最大的表面积.同时利用此条件下制备的Zn0纳米结构进行荧光检测，具有最大的荧光强度.因此，本研究建立了一种基于微液滴合成Zn0纳米结构的新方法，在纳米结构合成及生物医学检测方面具有潜在的应用前景.
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　　（責任编辑：张晶）
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