8个地理种群红条毛肤石鳖COI基因的遗传多样性分析

来源:用户上传      作者:徐浩文 马铭 黄玲

　　摘要 [目的]分析我国8个沿海潮间带红条毛肤石鳖地理种群的COI基因的遗传多样性。[方法]利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增8个地区80个红条毛肤石鳖样品的COI基因。使用DNASP5.10.01、MEGA7.0等软件对所得序列进行分析，得到片段碱基含量、遗传距离以及遗传多样性参数等数据，并通过构建系统发育树的方式，结合遗传多样性数据分析结果。[结果]获得的COI基因片段长度为659 bp，COI基因位于线粒体编码区中，平均A、T、C、G的碱基含量分别20.4%、41.7%、14.9%和23.0%，存在明显的AT偏向，结合Acanthochitona crinita为外群系统发育树的结果来看，中国沿海地区红条毛肤石鳖种群分成2个明显的聚群，将它们定义为北方群体和南方群体，遗传距离为0.000 66～0.087 85。单倍型遗传多样性数据显示，多样性数值较高，但核苷酸多样性较低。[结论]红条毛肤石鳖北方群体的遗传多样性与南方群体存在差异，2个群体应该分别采取相应措施来保护遗传多样性。
　　关键词 红条毛肤石鳖;COI基因;遗传多样性
　　Abstract [Objective] To analyze the genetic diversity of COI gene in Acanthochiton rubrolineatus from 8 littoral geographical populations of China.[Method] COI gene of 80 samples of A.rubrolineatus from 8 geographical populations were amplified by polymerase chain reaction （PCR technology）.And we used DNASP5.1001，MEGA7.0 and other softwares to analyze the sequences，calculate the data of fragment base content，distance and other genetic diversity parameters，and analyze the results by the means of constructing phylogenetic trees in combination of genetic diversity data.[Result]The length of COI gene fragment was 659 bp，COI gene was located in the encoding region of mitochondria，and the average content of bases A，T，G，C was 20.4%，41.7%，14.9%，23.0% respectively，showing a significant AT bias.Combined with the results of phylogenetic trees with the outgroup of Acanthochitona crinite，we found that all haplotypes of A.rubrolineatus populations in China coasts were clustered into two apparent geographic lineages in phylogenetic trees，named as Northern group and Southern group，the genetic distance ranged from 0.000 66 to 0.087 85.The results of haplotype genetic diversity reflected that Hd was high，but the nucleotide diversity was low.[Conclusion]There were obvious differences between the northern group and southern group of A.rubrolineatus in China，and the northern and southern group should be protected separately by taking some measures.
　　Key words Acanthochiton rubrolineatus;COI gene;Genetic diversity
　　紅条毛肤石鳖（Acanthochiton rubrolineatus）隶属软体动物门多板纲石鳖目毛肤石鳖科，生活在潮间带中、低潮区岩石岸，主要分布在我国黄渤海到广东沿岸，此外，日本也有分布[1]，是我国最常见的石鳖种群。石鳖属于多板纲比较原始的软体动物，包含超过940种现生种以及430种石鳖化石标本，在白垩纪至今漫长的进化历程中，其化石形态变化不大[2-3]，在研究软体动物的起源与进化中有重要的地位和意义，红条毛肤石鳖身体两侧对称，长椭圆形，背部中央凸出，并披有8块石灰质的壳板[4]，上面有3道暗红色横纹。相对于其他物种，石鳖物种没有明显的经济价值，目前未见到人工养殖石鳖的相关报道，但具有重要的环境指示价值，是良好的水质指示剂，对于保护生态环境具有重要的作用。目前对红条毛肤石鳖的研究主要集中在形态、齿舌新型磁性纳米材料、食用药用价值等方面[5-7]，而遗传多样性分析并不多见。遗传多样性是分析生物多样性重要的手段，通过种群遗传多样性的分析可以揭示进化历史和种群进化的可能性[8]，具有更高遗传多样性的物种或者种群能够更好地适应环境改变[9]，遗传多样性越高，或者变异越强的物种，其生存能力往往越强。探究红条毛肤石鳖遗传多样性对于了解石鳖乃至软体动物进化历程，对维持生物多样性具有重要的意义，同时遗传多样性的研究也可以对野生物种资源的保护和资源的可持续利用提供文献参考。 　　分子标记是以基因突变为基础来分析物种遗传与变异的方法，常见的分子标记有RNA核糖体（16S rRNA、28S rRNA）[10]、细胞色素B（cytochrome b，Cytb）[11]、细胞色素氧化酶亚基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）等[12]，笔者用到的分子标记是位于线粒体DNA中的COI基因。线粒体DNA是探究动物群体遗传学常用的分子标记，常用来进行群体遗传学的分析[13]，线粒体DNA不包含内含子、间隔区和重复序列，母系遗传，具有较高的序列替换速率[14]。COI基因是线粒体编码蛋白最大的一个编码区，变化速率快，相对于线粒体rRNA基因更加保守，被广泛应用在生物类群的种质鉴定和低阶分类阶元的系统学研究中[15-16]，在海洋动物遗传群体的研究中应用较为广泛[17-18]。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品采集 样品采集自我国沿海8个地区，包括大连（DL）、烟台（YT）、威海（WH）、青岛（QD）、连云港（LYG）、舟山（ZS）、玉环（YH）和厦门（XM）。采样的地点多为海岸潮间带礁石滩，采样时间选择退大潮时，具体采样方法参考张枫轩[19]的方法。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 DNA提取。取红条毛肤石鳖腹部肌肉组织，每次取绿豆粒大小的肌肉组织，将组织在1.5 mL离心管中充分剪碎，用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit，DP324-03）提取总DNA。总DNA使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA检测，胶图中出现清晰明亮条带，说明提取的DNA片段质量较高，可以进行后续的扩增操作，随后按照编号将结果较好的DNA置于-20 ℃冰箱中保存备用。
　　1.2.2 PCR扩增。通过GenBank数据库中查找石鳖COI序列，并通过Primer5.0软件遵循引物设计原则设计引物，得到正向反向引物序列分别为5′-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3′、5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC-3′，由上海生工生物公司合成，将引物稀释后按照22 μL水，25 μL Taq酶（TaKaRa TaqTM Version 2.0），1 μL DNA，上下游引物各1 μL的比例配成50 μL的反应体系，具体PCR反应程序如下：94 ℃ 预变性3 min;94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环;72 ℃延伸10 min后，温度降至室温，10 ℃下保存。
　　1.2.3 序列处理和分析。PCR所得产物经检测合格后送往上海生工生物有限公司进行测序，所得测序产物用DNAstar软件中的Seqman软件进行剪切与拼接，使用MEGA7.0软件对拼接序列进行比对，所有序列均在GenBank数据库中进行BLAST同源检测，确定为目的紅条毛肤石鳖的DNA序列;利用MEGA7.0对序列按地区进行分组整合，计算各组之间的遗传距离、各组之间碱基组成以及以Acanthochitona crinita为外群构建单倍型系统发育树，利用DNASP5.10.01软件对序列进行遗传多样性数据的收集分析等。
　　2 结果与分析
　　2.1 产物检测结果 PCR扩增后的产物电泳检测结果如图1所示，表明目的基因的扩增效果较好。
　　2.2 碱基含量分析 获得的COI基因片段裁切整齐对比后长度为659 bp，作为下一步分析使用，通过MEGA7.0分析得到碱基组成结果（表1）。由表1可知，红条毛肤石鳖的COI基因碱基片段各地区碱基组成差异不明显，碱基A、T、C、G的平均含量分别为20.4%、41.7%、14.9%和23.0%，存在明显的AT偏向，是一种比较普遍的碱基偏向性，其他生物的研究中也报道过这种碱基偏向[20-21]。
　　2.3 各地区遗传距离分析 通过MEGA7.0软件计算各地理种群间遗传距离，所得结果见表2。由表2可知，各地理种群间遗传距离为0.000 66～0.087 85，遗传距离差距较大。北方地理种群遗传距离为0.002 96～0.016 10，南方地理种群的遗传距离为0.000 66～0.087 85，南北方地理种群间遗传距离较大，说明南北方地理种群间存在较大的分化差异，南方地理种群的分化程度更大。
　　2.4 红条毛肤石鳖COI基因遗传多样性分析 通过DNASP软件对红条毛肤石鳖种群进行遗传多样性分析结果见表3。由表3可知，COI基因片段的变异位点（S）为8～24个，单倍型多样性（Hd）为0.844～1.000，核苷酸多样性（π）为0.004 07～0.012 75，各地区单倍型多样性数值较高，但核苷酸多样性指数较低，该结果与王儒晓等[22]的研究结果相一致。Tajima’s D 检验[23]和Fu’s Fs检验[24]常被用于评估种群的历史动态。Tajima’s D和Fu’s Fs的检验结果如果是负数，且脱离中性检测比较明显，说明种群或许经历过群体的扩张。从表3可以看出，南方种群的扩张比较明显，北方种群除威海可能由于遗传漂变出现了正值，其他地区也都出现了不同程度的扩张，其中，北方种群中青岛的扩张程度比较大，南方种群中玉环和厦门的扩张程度较大，具体扩张时间还需要借助其他手段进行探讨。
　　2.5 系统发育树分析 系统发育树常常被用来反映物种间的进化关系，基于COI基因片段以Acanthochitona crinita为外群构建系统发育树的结果如图2所示。从图2可以看出，来自8地区80条序列共定义了26个单倍型，结果显示以连云港为界限的北方与南方2个群体的单倍型分成2个明显的进化枝，红色代表北方区域的单倍型集合，蓝色代表南方区域的单倍型集合，2个集合之间存在明显的遗传差异，系统发育树分析结果与遗传距离结果相一致，说明南北方地区红条毛肤石鳖存在较大的分化差异。 　　3 结论
　　红条毛肤石鳖是石鳖中分布很狭隘的一个种群，由于其特殊的生活习性，人们往往容易将它忽略。这个物种具有较高的科学研究价值和生态价值，但是由于近年来频繁的人类活动，海水污染严重以及生态环境被破坏等因素影响，红条毛肤石鳖的野生种群数目正在急剧下降，为了阻止这种趋势，对红条毛肤石鳖进行一个综合的遗传多样性分析来寻求对策建立保护措施显得尤为必要。笔者分析了来自我国8个地区红条毛肤石鳖的遗传多样性，结果显示出我国红条毛肤石鳖存在明显的南北方分化差距，在进行生物多样性保护时应区分南方地区以及北方地区，分别采取对应措施来保护野生的红条毛肤石鳖种群。
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