基于SSR分子标记的糯玉米遗传多样性研究

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　　摘要：为明确糯玉米自交系间的亲缘关系，利用19对简单重复序列（SSR）标记对32份糯玉米自交系进行遗传多样性分析，共检测到80个等位基因变异，每个位点可检测到2～7个等位基因变异，平均每个位点检测到4.21个。通过NTSYS聚类分析方法，在遗传相似系数为0.53处将32份糯玉米自交系划分为6个类群，分别包含3份、2份、11份、11份、2份和3份，其中亲缘关系较近的白糯6和突变体N17聚在了一起，3个杂交种（郑黄糯2号、石彩糯和京科糯）的父母本被划分在不同的类群中，进一步从分子水平上揭示了亲本种质的遗传差异与玉米杂种优势的关系，为玉米育种和改良奠定了理论基础。
　　关键词：糯玉米;SSR;遗传多样性;聚类分析
　　中图分类号： S513.032
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）02-0083-04
　　收稿日期：2019-01-14
　　作者简介：杨亚桐（1994—），男，河北河间人，硕士研究生，主要从事作物遗传资源与利用研究。E-mail：1539245869@qq.com。
　　通信作者：段会军，博士，教授，主要从事作物遗传资源与利用研究。E-mail：hjduan@hebau.edu.cn。
　　糯玉米（Zea mays L. var. ceratina Kulesh）是玉米属的一个亚种[1]，是普通玉米第9染色体短臂上的Wx基因发生隐性突变形成的一种蒸煮后呈糯性的突变体[2-3]，由于糯玉米籽粒干燥后胚乳呈角质不透明、无光泽的蜡质状，所以又被称作蜡质玉米[4]。根据糯玉米籽粒的颜色可以分为：白糯、黄糯、紫糯、黑糯以及彩糯等，其中白糯和黄糯较为常见[5]。糯玉米具有富含支链淀粉[6]、营养丰富和适口性良好等优良特性，现已成为深受人们欢迎的食品和工业原料，具有较高的经济价值。
　　SSR（simple sequence repeats，简单重复序列）又称为微卫星DNA[7]，是共显性分子标记，是建立在PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）基础之上的一种遗传标记，具有很高的多态性和覆盖率，测得结果的稳定性和重复性比较好，试验操作程序简单，对DNA的数量和纯度要求较低[8]。国内外研究学者在玉米遗传多样性方面做了大量的研究工作，李锐等利用SSR技术对来源于144份甜玉米群体的40个位点进行了分析，共检测到343个等位变异，每对引物测出4-17个等位变异，平均8.58个，SSR聚类分析将144份甜玉米群体划为7个类群[9];谷静丛利用28对SSR引物对110份普通玉米自交系进行遗传多样性分析，将其划分为六大类群，19个亚类群[10];Warburton等[11]、Reif等[12]的研究结果证实了利用SSR标记进行玉米遗传多样性及杂种优势群划分的可行性。
　　尽管SSR分子标记较普遍地应用于植物的遗传多样性研究上，但在糯玉米种质资源中的研究报道比较少。本研究利用SSR分子标记对32份糯玉米自交系进行遗传多样性分析，确定供试糯玉米自交系间的遗传背景差异，为糯玉米优良品种选育和杂种优势模式构建提供研究基础和理论依据。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　供试材料选自河北农业大学鲜食玉米课题组选育的26份糯玉米自交系，编号为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11、N12、N13、N14、N15、N16、N17（白糯6突变体）、N18、N19（石白糯1号）、N20、N21、N22、N23、N24、N25、N26和引进的国审糯玉米品种郑黄糯2号父母本（郑黄糯04、郑黄糯03）、石彩糯父母本（石糯1号、石糯2号）及京科糯父母本（白糯6、京糯6）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 用CTAB法提取玉米叶片基因组DNA 将玉米种子浸泡1夜，播种（每个品种播3粒）;待玉米长到3～4叶时取叶提取玉米基因组DNA。具体提取步骤：（1）将无水乙醇放入-20 ℃冰箱中预冷，CTAB放入65 ℃水浴锅中预热1 h。（2）取新鲜玉米叶片加入适量已预热好的CTAB中研磨，分别装入1.5 mL离心管中，放入65 ℃水浴锅中水浴60～75 min。（3）从水浴锅中取出，加入等体积的氯仿异戊醇（24 ∶1）。使用摇床摇晃或用手上下翻转 20 min。（4）放入离心机中，10 000 r/min离心 10 min。（5）取上清液至新离心管中，加入等体积氯仿异戊醇，摇晃15 min。放入离心机中，10 000 r/min离心10 min。（6）取上清液至新的离心管中，加入 -20 ℃ 预冷好的无水乙醇至1.5 mL，缓缓摇晃，出现白色絮状沉淀（DNA），放入冰箱-20 ℃中冷却 5 min。（7）从冰箱中取出DNA，放入离心机中离心，10 000 r/min，10 min，弃上清液。（8）加入75%乙醇（75 mL 95%乙醇+20 mL蒸馏水）70 μL，将DNA弹起，摇晃10 min，充分洗涤DNA，放入离心机中 10 000 r/min离心2～3 min。弃上清，共洗脱3次。（9）将洗脱好的DNA开盖晾干，晾1夜即可，第2天可加去离子水溶解（100 μL）。（10）测量DNA浓度（放-20 ℃冰箱中保存）。
　　1.2.2 SSR引物 选用19对SSR引物（表1），由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
　　1.2.3 PCR反应 20 μL PCR反应体系如下：cDNA 2.0 μL;Buffer 2.0 μL;上下游引物各1.0 μL;Taq DNA Polymerase 0.2 μL;dNTP 1.6 μL;ddH2O 12.2 μL。体系混合均匀后加1小滴矿物油（全过程在冰上进行）。
　　PCR程序为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性 40 s，X ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30个循环;72 ℃延伸5 min。10 ℃保温。注意X ℃退火，具体退火温度参考引物Tm值;扩增完成后，放入冰箱4 ℃保存。 　　1.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 在每个DNA体系中加入2 μL的Loading buffer，磕打混匀后，放于冰箱4 ℃中保存。（1）清洗玻璃板：用洗洁精将玻璃板在水龙头下冲洗干净，再用蒸馏水洗净，晾干。（2）封琼脂糖胶：待玻璃板晾干后，组装，用1%琼脂糖封底缝。开始配制琼脂糖（0.4 g琼脂糖+40 mL去离子水），在微波炉里加热至液体呈透明状时取出，晾至45 ℃左右时，用注射器吸取琼脂糖均匀注射到2个玻璃板底部，封好。（3）晾至琼脂糖凝胶颜色为白色时，安装电泳槽。（4）非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：将40 mL的10% Acrylamide胶贮存液加到锥形瓶中。灌胶前加入560 μL 10%过硫酸铵，25 μL TEMED，并迅速混匀。（5）灌胶：制胶后迅速混匀开始灌胶，把胶沿玻璃板边缘缓慢匀速地灌进，在灌入的过程中可以轻轻敲打防止出现气泡。双手分别拿梳子的三分之一处平行插入。（6）将电泳槽翻转90°放置，使其聚合至少40 min。（7）点样：将电泳槽放正，倒入1×TAE缓冲液没过较低的玻璃板上端，向上垂直拔出梳子，若有气泡则先吹赶气泡。在点样孔中点样2 μL，其中Marker点1 μL即可。（8）电泳：连接电泳仪，设置（300 V，200 mA，100 W），恒功率电泳至溴酚蓝跑到胶板底部停止电泳。（9）电泳结束后，倒出缓冲液，卸下电泳装置，取出胶片，用去离子水漂洗1 min。（10）银染：将胶放入刚配制好的银染液（0.6 g AgNO3+300 mL 去离子水）中，轻轻摇晃染色1 min，倒出银染液，用去离子水洗涤30 s，洗涤2次。（11）显影：将胶放入显影液（6 g NaOH+400 mL去离子水+4 mL 甲醛）中，摇晃至出现清晰的条带，取出，用去离子水洗2次，每次20 s。（12）保存并拍照。
　　2 数据处理
　　根据DNA的SSR扩增图谱结果，建立SSR的0到1数据库，即在同一引物的SSR扩增产物的同一迁移率位置上，有带的记为1，无带的记为0。最后在NTSYS软件中进行聚类分析。
　　3 结果与分析
　　3.1 扩增结果分析
　　利用19对SSR引物对32个糯玉米自交系进行PCR反应，扩增出的条带清晰而稳定（图1），共检测到80个等位基因位点，每对SSR引物检测出的等位基因数为2～7个，平均每个SSR位点检测出的等位基因数为4.21个。
　　3.2 基于SSR分子标记的遗传多样性分析
　　本研究根据UPGMA方法，得出32份糯玉米自交系间的遗传相似系数，其变化范围在0.53～0.83，平均值为0.68，说明其遗传多样性不明显，遗传基础相对狭窄。
　　3.3 聚类分析
　　聚类分析树状图结果如图2所示，在相似系数为0.53处可将32份糯玉米自交系划分为Ⅵ类。第Ⅰ类群包括N15、N11和N10;第Ⅱ类群包括N1和石糯1号;第Ⅲ类群包括N8、N9、N13、N16、N23、N24、郑黄糯03、N20、N22、白糯6和N17;第Ⅳ类群包括N2、N3、N4、N12、N6、N14、郑黄糯04、N21、京糯6、N26和N25;第Ⅴ類群包括N5和N7;第Ⅵ类群包括N18、石糯2号和N19。
　　4 讨论
　　近年来，分子标记技术发展迅速，这为在分子水平上研究玉米的遗传多样性提供了新的手段[13]。相对于SSR分子标记技术[14]，RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）试验操作繁琐，检测周期长，成本高昂[15];RAPD（random amplified polymorphism DNA，随机扩增多态性）的PCR退火温度相对较低，重复性和稳定性较差[16]。本研究利用19对SSR引物对32个糯玉米自交系进行PCR扩增，共检测到80个等位基因变异，每个位点可检测到等位基因变异为2～7个，平均每个检测位点检测到的等位基因数为4.21个，扩增条带清晰而稳定，较好地揭示了参试糯玉米自交系的遗传多样性，与孟强等的研究结果[17-18]基本一致。由于采用不同数量的分子标记会影响遗传多样性分析结果的准确性，因此利用覆盖全基因组、高密度的分子标记进行种质资源的遗传多样性分析，可避免遗传信息的低估，在今后的玉米遗传育种实践中，应利用先进的生物技术发掘更多的多态性高的标记。
　　本试验根据UPGMA方法，得出32份糯玉米自交系间的遗传相似系数，其变化范围在0.53～0.83，平均值为0.68，说明其遗传多样性不明显，遗传基础相对狭窄，这与选取的材料亲缘关系相近有关。所以，在今后的玉米遗传育种实践中，应加强糯玉米种质资源的收集，拓宽糯玉米种质资源的遗传多样性。
　　本研究利用聚类分析方法将32份供试糯玉米自交系分为Ⅵ类，其中石糯2号与N19来源于同一地区，亲缘关系相近，在树状图中被分为一类;白糯6与其突变体N17被分到第Ⅲ类群，与遗传系谱分析一致，也间接表明本研究结果的真实可靠;郑黄糯2号父母本、石彩糯父母本及京科糯父母本均被划分到不同类群，进一步从分子水平上揭示了亲本种质的遗传差异与玉米杂种优势的关系，为玉米育种和改良奠定了理论基础。
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