4个香菇品种的AFLP分子标记研究

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　　摘要    试验以香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1等4个品种为研究材料，采用AFLP分子标记技术分析其遗传多样性。结果表明，4个香菇品种之间的遗传相似性系数变化范围为0.669 5～0.878 7;UPGMA法聚类分析发现，4个品种分为2组，香菇LB-21与香菇B15-1亲缘关系较近，遗传相似性系数为0.874 5，香菇L808与香菇215亲缘关系较近，遗传相似性系数为0.878 7。
　　关键词    香菇;AFLP分子标记;遗传多样性;聚类分析
　　中图分类号    S646.12        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）09-0047-02
　　Abstract    The genetic diversity of LB-21，L808，215 and B15-1 Lentinus edodes varieties was analyzed by AFLP molecular marker.The results showed that the variation range of genetic similarity coefficient among the four Lentinus edodes varieties was 0.669 5-0.878 7.UPGMA clustering analysis showed that the four varieties were divided into two groups，LB-21 and B15-1 were closely related，and the genetic similarity coefficient was 0.874 5. L808 and 215 were closely related，and the genetic similarity coefficient was 0.878 7.
　　Key words    Lentinus edode;AFLP molecular marker;genetic diversity;clustering analysis
　　香菇（Lentinus edodes（Berk.）sing）又名香蕈、冬菇、花菇、椎茸等，在分类学上隶属于担子亚门层菌纲伞菌目侧耳科香菇属[1]。其味道鲜美，营养丰富，药用价值较高，是世界第二大食用菌，也是世界真菌学家研究的热点。我国香菇栽培历史悠久，栽培面积逐年增加，菌种选育和栽培技术研究等工作受到了科研工作者的重视。香菇菌种是香菇产业化发展的重要基础，决定了其产量和质量。从分子生物学水平鉴定菌种和构建DNA指纹图谱有助于准确识别菌种，从而有效地利用不同香菇品种的优势，促进香菇生产的发展[2]。
　　目前，应用于香菇种质资源研究的分子标记主要有SSR、AFLP、RAPD、SCAR、SRAP[3-7]。AFLP分子标记技术具有模板量少、引物通用性高、多态检出率高、稳定性和重復性较强等优点，广泛应用于植物分子遗传图谱构建、遗传多样性及亲缘关系研究、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域[8-9]。本试验利用AFLP分子标记技术分析不同香菇品种的遗传多样性，从基因水平反应品种之间的关系，为进一步开展香菇生物学研究提供一定的试验依据。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料
　　供试香菇品种共4个，即香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1，均来自陕西省微生物研究所微生物菌种资源中心第三研究室。香菇LB-21是选育品种，抗霉菌能力强、产量高，经小面积栽培产量稳定;香菇L808是广温型品种，菇体中等偏大、菇形圆整、菇柄较短、菇质优、菌龄短，产量高;香菇215是中高温型品种，菌肉厚实，菌柄中长偏短，抗逆性强，产量高;香菇B15-1是野生香菇菌株，抗杂菌污染能力强，柄短肉厚。
　　1.2    主要试剂及引物
　　主要试剂有Taq酶（2 U/μL）、dNTP（10 mmol/L）、引物（10 mmol/L）（生工基因）、内切酶（10 U/μL）（NEB公司）、T4连接酶（5 U/μL）（NEB公司）。Marker为DL2000、100 bp DNA Ladder。引物在北京六合华大基因科技有限公司合成。试验所用接头和引物信息见表1，试验所用引物组合见表2。
　　1.3    试验方法
　　1.3.1    样品DNA提取。采用改良CTAB法进行DNA提取，用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
　　1.3.2    限制性内切及连接。对所选样品采用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切，酶切与连接反应同步进行。酶切与连接体系（20 μL）为：10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL，AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL，EcoR I Adaptor 1 μL（10 μmol/L），Mse I Adaptor 1 μL（10 μmol/L），模板DNA 5 μL，用ddH2O补至20 μL。酶切-连接反应条件为25 ℃、5 h，1%琼脂糖电泳检测。
　　1.3.3    预扩增。预扩增反应体系：2×PCR Mix 10 μL，E00 1 μL（20 μmol/L），M00 1 μL（20 μmol/L），酶切-连接模板DNA 4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s;50 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;将预扩增产物4 ℃保存备用。 　　1.3.4    选择性扩增。将预扩增产物稀释后作为模板进行PCR扩增。反应体系：2×PCR Mix 10 μL，Eprimer 1 μL（20 μmol/L），Mprimer 1 μL（20 μmol/L），模板DNA 5 μL（预扩产物稀释20倍），加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性35 s，65 ℃复性35 s（每循环降低0.7 ℃），72 ℃延伸1 min，12个循环;94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，23个循环。
　　1.3.5    聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。选择扩增PCR产物和上样缓冲液比例8∶3，旋涡混匀，94 ℃变性10 min后，于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。利用Quantity One软件对4个样品、12对引物组合扩增产物测序仪得到的原始数据进行分析，根据无带和有带情况转化为0和1数据矩阵。采用NTSYSpc 2.11软件包进行个体相似系数计算，并采用UPGMA法进行聚类分析，利用popgene和NTSYS软件对样品进行遗传多样性分析。
　　2    结果与分析
　　2.1    聚丙烯酰胺凝胶分析
　　利用12对随机引物组合对4个香菇品种的基因组DNA进行扩增，AFLP扩增产物长度介于100～500 bp之间，条带清晰。扩增电泳图谱见图1。
　　扩增条带总数为239条，其中多态性条带为100条;引物组合P5扩增出的多态性条带最多，多态百分比为65.38%;引物组合P9扩增出的多态性条带最少，多态百分比为15.38%。
　　2.2    品种多态性分析
　　由表3可知，香菇LB-21扩增出的条带总数为180条，其中多态性条带41条，多态比率最低，为22.78%，特有条带2条;香菇L808、香菇215分别扩增出195、188条，多态性条带分别为52、49条，其中特有条带分别为12、2条;香菇B15-1扩增出的条带总数为196条，多态性条带57条，多态比率最高，为29.08%，含特有条带7条。
　　2.3    遗传相似性系数分析
　　由表4可知，4个香菇品种之间的遗传相似性系数变化范围为0.669 5～0.878 7。香菇LB-21与香菇L808、香菇215之间的遗传性系数较小，说明遗传距离较远;与香菇B15-1之间的遗传相似性系数较高，为0.874 5。香菇L808与香菇215之间的遗传相似性系数较高，为0.878 7;与香菇B15-1之间的遗传性系数较小，说明遗传距离较远。
　　2.4    聚类分析
　　采用UPGMA法进行聚类分析，得到4个香菇品种的亲缘关系树状图。从图2可以看出，4个香菇品种被分为了2组，其中香菇LB-21与香菇B15-1为一组，说明这2个品种亲缘关系相对较近，遗传相似性系数为0.874 5;香菇L808与香菇215为一组，两者亲缘关系较近，遗传相似性系数为0.878 7。
　　3    结论
　　试验结果表明，采用12对随机引物组合扩增4个香菇品种基因组DNA，香菇B15-1擴增条带总数为196条，多态性条带57条，多态比率最高（29.08%），含有特有条带7条
　　香菇L808、香菇215扩增条带总数分别为195、188条，多态性条带分别为52、49条，其中特有条带分别为12、2条;香菇LB-21扩增条带总数为180条，其中多态性条带41条，多态比率最低（22.78%），特有条带2条。
　　4个香菇品种之间的遗传相似性系数变化范围为0.669 5～0.878 7。采用UPGMA法进行聚类分析，结果发现，4个品种被分成了2组，其中香菇LB-21与香菇B15-1为一组，说明这2个品种亲缘关系相对较近，遗传相似性系数为0.874 5;香菇L808与香菇215为一组，两者亲缘关系较近，遗传相似性系数为0.878 7。
　　4    参考文献
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　　[4] 程水明，干建平，刘世旺，等.AFLP分子标记在香菇F1代群体中的多态性及分离方式[J].湖北农业科学，2009，48（12）：2922-2926.
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　　[9] 王晓英，郭廷松，王新花，等.4个苹果品种的AFLP分子标记研究[J].山东农业大学学报（自然科学版），2018，49（1）：90-93.
　　基金项目   陕西省科技厅农业领域重点研发计划项目（2017NY-010）。
　　作者简介   雷萍（1966-），女，陕西西安人，副研究员，从事食药用真菌的研究与开发工作。
　　通信作者
　　收稿日期   2019-01-22
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