4个香菇品种的AFLP分子标记研究

作者:未知

  摘要    试验以香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1等4个品种为研究材料,采用AFLP分子标记技术分析其遗传多样性。结果表明,4个香菇品种之间的遗传相似性系数变化范围为0.669 5~0.878 7;UPGMA法聚类分析发现,4个品种分为2组,香菇LB-21与香菇B15-1亲缘关系较近,遗传相似性系数为0.874 5,香菇L808与香菇215亲缘关系较近,遗传相似性系数为0.878 7。
  关键词    香菇;AFLP分子标记;遗传多样性;聚类分析
  中图分类号    S646.12        文献标识码    A        文章编号   1007-5739(2019)09-0047-02
  Abstract    The genetic diversity of LB-21,L808,215 and B15-1 Lentinus edodes varieties was analyzed by AFLP molecular marker.The results showed that the variation range of genetic similarity coefficient among the four Lentinus edodes varieties was 0.669 5-0.878 7.UPGMA clustering analysis showed that the four varieties were divided into two groups,LB-21 and B15-1 were closely related,and the genetic similarity coefficient was 0.874 5. L808 and 215 were closely related,and the genetic similarity coefficient was 0.878 7.
  Key words    Lentinus edode;AFLP molecular marker;genetic diversity;clustering analysis
  香菇(Lentinus edodes(Berk.)sing)又名香蕈、冬菇、花菇、椎茸等,在分类学上隶属于担子亚门层菌纲伞菌目侧耳科香菇属[1]。其味道鲜美,营养丰富,药用价值较高,是世界第二大食用菌,也是世界真菌学家研究的热点。我国香菇栽培历史悠久,栽培面积逐年增加,菌种选育和栽培技术研究等工作受到了科研工作者的重视。香菇菌种是香菇产业化发展的重要基础,决定了其产量和质量。从分子生物学水平鉴定菌种和构建DNA指纹图谱有助于准确识别菌种,从而有效地利用不同香菇品种的优势,促进香菇生产的发展[2]。
  目前,应用于香菇种质资源研究的分子标记主要有SSR、AFLP、RAPD、SCAR、SRAP[3-7]。AFLP分子标记技术具有模板量少、引物通用性高、多态检出率高、稳定性和重復性较强等优点,广泛应用于植物分子遗传图谱构建、遗传多样性及亲缘关系研究、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域[8-9]。本试验利用AFLP分子标记技术分析不同香菇品种的遗传多样性,从基因水平反应品种之间的关系,为进一步开展香菇生物学研究提供一定的试验依据。
  1    材料与方法
  1.1    试验材料
  供试香菇品种共4个,即香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1,均来自陕西省微生物研究所微生物菌种资源中心第三研究室。香菇LB-21是选育品种,抗霉菌能力强、产量高,经小面积栽培产量稳定;香菇L808是广温型品种,菇体中等偏大、菇形圆整、菇柄较短、菇质优、菌龄短,产量高;香菇215是中高温型品种,菌肉厚实,菌柄中长偏短,抗逆性强,产量高;香菇B15-1是野生香菇菌株,抗杂菌污染能力强,柄短肉厚。
  1.2    主要试剂及引物
  主要试剂有Taq酶(2 U/μL)、dNTP(10 mmol/L)、引物(10 mmol/L)(生工基因)、内切酶(10 U/μL)(NEB公司)、T4连接酶(5 U/μL)(NEB公司)。Marker为DL2000、100 bp DNA Ladder。引物在北京六合华大基因科技有限公司合成。试验所用接头和引物信息见表1,试验所用引物组合见表2。
  1.3    试验方法
  1.3.1    样品DNA提取。采用改良CTAB法进行DNA提取,用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
  1.3.2    限制性内切及连接。对所选样品采用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切,酶切与连接反应同步进行。酶切与连接体系(20 μL)为:10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL,AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL,EcoR I Adaptor 1 μL(10 μmol/L),Mse I Adaptor 1 μL(10 μmol/L),模板DNA 5 μL,用ddH2O补至20 μL。酶切-连接反应条件为25 ℃、5 h,1%琼脂糖电泳检测。
  1.3.3    预扩增。预扩增反应体系:2×PCR Mix 10 μL,E00 1 μL(20 μmol/L),M00 1 μL(20 μmol/L),酶切-连接模板DNA 4 μL,加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s;50 ℃复性30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;将预扩增产物4 ℃保存备用。   1.3.4    选择性扩增。将预扩增产物稀释后作为模板进行PCR扩增。反应体系:2×PCR Mix 10 μL,Eprimer 1 μL(20 μmol/L),Mprimer 1 μL(20 μmol/L),模板DNA 5 μL(预扩产物稀释20倍),加ddH2O至20 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性35 s,65 ℃复性35 s(每循环降低0.7 ℃),72 ℃延伸1 min,12个循环;94 ℃变性30 s,56 ℃复性30 s,72 ℃延伸1 min,23个循环。
  1.3.5    聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。选择扩增PCR产物和上样缓冲液比例8∶3,旋涡混匀,94 ℃变性10 min后,于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析,银染后观察。利用Quantity One软件对4个样品、12对引物组合扩增产物测序仪得到的原始数据进行分析,根据无带和有带情况转化为0和1数据矩阵。采用NTSYSpc 2.11软件包进行个体相似系数计算,并采用UPGMA法进行聚类分析,利用popgene和NTSYS软件对样品进行遗传多样性分析。
  2    结果与分析
  2.1    聚丙烯酰胺凝胶分析
  利用12对随机引物组合对4个香菇品种的基因组DNA进行扩增,AFLP扩增产物长度介于100~500 bp之间,条带清晰。扩增电泳图谱见图1。
  扩增条带总数为239条,其中多态性条带为100条;引物组合P5扩增出的多态性条带最多,多态百分比为65.38%;引物组合P9扩增出的多态性条带最少,多态百分比为15.38%。
  2.2    品种多态性分析
  由表3可知,香菇LB-21扩增出的条带总数为180条,其中多态性条带41条,多态比率最低,为22.78%,特有条带2条;香菇L808、香菇215分别扩增出195、188条,多态性条带分别为52、49条,其中特有条带分别为12、2条;香菇B15-1扩增出的条带总数为196条,多态性条带57条,多态比率最高,为29.08%,含特有条带7条。
  2.3    遗传相似性系数分析
  由表4可知,4个香菇品种之间的遗传相似性系数变化范围为0.669 5~0.878 7。香菇LB-21与香菇L808、香菇215之间的遗传性系数较小,说明遗传距离较远;与香菇B15-1之间的遗传相似性系数较高,为0.874 5。香菇L808与香菇215之间的遗传相似性系数较高,为0.878 7;与香菇B15-1之间的遗传性系数较小,说明遗传距离较远。
  2.4    聚类分析
  采用UPGMA法进行聚类分析,得到4个香菇品种的亲缘关系树状图。从图2可以看出,4个香菇品种被分为了2组,其中香菇LB-21与香菇B15-1为一组,说明这2个品种亲缘关系相对较近,遗传相似性系数为0.874 5;香菇L808与香菇215为一组,两者亲缘关系较近,遗传相似性系数为0.878 7。
  3    结论
  试验结果表明,采用12对随机引物组合扩增4个香菇品种基因组DNA,香菇B15-1擴增条带总数为196条,多态性条带57条,多态比率最高(29.08%),含有特有条带7条
  香菇L808、香菇215扩增条带总数分别为195、188条,多态性条带分别为52、49条,其中特有条带分别为12、2条;香菇LB-21扩增条带总数为180条,其中多态性条带41条,多态比率最低(22.78%),特有条带2条。
  4个香菇品种之间的遗传相似性系数变化范围为0.669 5~0.878 7。采用UPGMA法进行聚类分析,结果发现,4个品种被分成了2组,其中香菇LB-21与香菇B15-1为一组,说明这2个品种亲缘关系相对较近,遗传相似性系数为0.874 5;香菇L808与香菇215为一组,两者亲缘关系较近,遗传相似性系数为0.878 7。
  4    参考文献
  [1] 卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州:河南科学技术出版社,2000.
  [2] 卓英,谭琦,陈明杰,等.香菇主要栽培菌株遗传多样性的AFLP分析[J].菌物学报,2006,25(2):203-210.
  [3] 董慧,章炉军,张美彦,等.中国香菇主栽品种遗传多样性的SSR分析及指纹图谱构建[J].微生物学通报,2017,44(6):1427-1436.
  [4] 程水明,干建平,刘世旺,等.AFLP分子标记在香菇F1代群体中的多态性及分离方式[J].湖北农业科学,2009,48(12):2922-2926.
  [5] 叶长文,谭海芹,吴应淼,等.香菇135和9015品种遗传多样性的RAPD分子标记研究[J].浙江大学学报(理学版),2013,40(2):230-233.
  [6] 赵微微,李海波,付立忠,等.47个香菇主栽菌株的SCAR标记分子鉴别[J].食用菌学报,2010,17(2):7-14.
  [7] 刘靖宇,宋秀高,叶夏,等.香菇菌株遗传多样性ISSR、RAPD和SRAP综合分析[J].食用菌学报,2011,18(3):1-8.
  [8] 陈立佼,柴红梅,黄兴奇,等.尖顶羊肚菌遗传多样性的AFLP分析[J].食用菌学报,2013,20(2):12-19.
  [9] 王晓英,郭廷松,王新花,等.4个苹果品种的AFLP分子标记研究[J].山东农业大学学报(自然科学版),2018,49(1):90-93.
  基金项目   陕西省科技厅农业领域重点研发计划项目(2017NY-010)。
  作者简介   雷萍(1966-),女,陕西西安人,副研究员,从事食药用真菌的研究与开发工作。
  通信作者
  收稿日期   2019-01-22
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