采用网络药理学研究桃仁—红花药对治疗股骨头坏死的分子机制

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　　摘 要 目的：研究桃仁-紅花药对治疗股骨头坏死（ONFH）的作用机制。方法：采用网络药理学方法。以化合物口服利用度（OB）>30%和类药性（DL）>0.18为标准，通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）、反向分子对接服务器（DRAR-CPI）、人类基因数据库（GeneCards）和在线《人类孟德尔遗传》数据库（OMIM）筛选桃仁-红花药对的活性成分及治疗ONFH的作用靶标。借助网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.6.0构建活性成分- ONFH靶标网络。结合STRING数据库构建靶蛋白相互作用网络，筛选连接度排名前5的靶蛋白，并利用分子对接服务器预测其与桃仁-红花药对活性成分的结合活性。利用生物学信息注释数据库（DAVID）对靶点基因本体（GO）生物过程和京都基因与基因组百科全书（KEGG）中代谢通路进行富集分析。结果：从桃仁-红花药对中筛选出活性成分44个，包括黄芩苷、槲皮素等，与ONFH相关的作用靶点78个，包括血管内皮生长因子（VEGF）、内皮细胞生长抑制因子（VEGI）、急性C反应蛋白（CRP）等。经分子对接服务器分析发现，桃仁-红花药对的活性成分与靶蛋白结合能力较强。经GO和KEGG通路富集分析发现，桃仁-红花药对治疗ONFH的生物过程与凋亡过程负向调节、核转录因子κB活动的正向调节等有关，主要通过调节分泌型糖蛋白信号通路、黑色素生成信号通路、VEGF信号通路、基底部细胞癌信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路等发挥作用。结论：本研究初步明确了桃仁-红花药对治疗ONFH的主要靶标和通路，可为后续进一步研究其药理作用奠定基础。
　　关键词 桃仁-红花药对；股骨头坏死；作用机制；网络药理学；中药系统药理学分析平台；通路
　　Study on the Mechanism of Prunus persica-Carthamus tinctorius Couplet Medicine in the Treatment of Osteonecrosis of the Femeral Head Based on Network Pharmacology
　　DONG Hang1，XIE Yizi2，HUANG Jiahua2，JI Shuliang2，SUN Weipeng2，SUN Zhizhong2，ZENG Xiashi2，SHEN Danting2，LIN Ziling1（1.Dept. of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；2.First Clinical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Prunus persica-Carthamus tinctorius couplet medicine in the treatment of osteonecrosis of the femoral head （ONFH）. METHODS： The network pharmacology was adopted. The active components of P. persica -C. tinctorius couplet medicine and ONFH target were screened through TCM systematic pharmacological analysis platform target （TCMSP）， DRAR-CPI， hnuman gene database （GeneCards） and online medelian inheritance in man （OMIM） using oral availability of compounds （OB）>30% and drug like （DL）>0.18 as standard. Network topology attribute analysis software Cytoscape 3.6.0 was utilized to construct the active components-ONFH targets network. Target protein interaction network was established on the basis of STRING database， and top 5 target proteins in the list of connectivity were screened， and molecular docking server was used to predict the combination activity of active components from P. persica -C. tinctorius couplet medicine. The biological processes of target gene ontology （GO） and metabolic pathways in Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） were enriched and analyzed by DAVID. RESULTS： A total of 44 active components were screened from P. persica -C. tinctorius couplet medicine， including baicalin， quercetin， etc.， and 78 targets related to ONFH including VEGF， VEGI， CRP， etc. Through analysis of molecular docking server， binding activity of active components of P. persica -C. tinctorius couplet medicine to target protein was strong. GO and KEGG pathway enrichment analysis showed that biological process of P. persica -C. tinctorius couplet medicine for ONFH was related with negative regulation of apoptosis process and positive regulation of nuclear factor-κB transcription factor， mainly through regulating secretory glycoprotein signaling pathway， melanogenesis signaling pathway， VEGF signaling pathway， signaling pathway of basal cell carcinoma， adenosine-activated protein kinase signaling pathway. CONCLUSIONS： This study preliminarily validates the major targets and pathways of P. persica -C. tinctorius couplet medicine for ONFH， which lay a foundation for further study on their pharmacological action. 　　KEYWORDS Prunus persica-Carthamus tinctorius couplet medicine； Osteonecrosis of the femoral head； Mechanism； Network pharmacology； TCM systematic pharmacological analysis platform； Pathway
　　股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是指由于各种原因引起的股骨头缺血，导致股骨头的结构发生改变或者股骨头塌陷，临床症状以髋部疼痛、跛行、髋关节屈曲、外旋功能障碍为主，是常见的骨科疾病之一[1]。流行病学资料统计表明，我国每年约有15万到20万新发ONFH患者，多见于30～50岁的青壮年[2-3]。目前，临床上还没有特异有效的药物治疗ONFH，大多数患者后期需行手术治疗，但病情易反复且治疗费用高[4]，降低了患者的生活质量，也给患者带来了巨大的经济负担。
　　桃仁-红花药对是《医宗金鉴》中桃红四物汤、《医林改错》中补阳还五汤的重要药材组合。在《神农本草经》中提到桃仁具有散瘀血的功效；红花具有活血通经、散瘀止痛的功效，两者合用可起到活血化瘀的功效。现代药理研究结果表明，桃仁具有改善血流动力学、抗炎、镇痛、提高免疫力等作用，红花具有抗氧化、抗细胞凋亡等作用[5-6]。相关研究也发现，含有桃仁-红花药对的方剂能够通过促进坏死组织修复、改善异常血液流变状态、抑制破骨、降低成脂因子表达等机制改善ONFH[7-8]。
　　虽然相关研究探讨了桃仁-红花药对改善ONFH的单一作用机制，但难以全面地反映其药理作用机制。网络药理学是基于生物信息学、系统生物学、药理学等多个学科的技术和知识，可构建药物的“成分-靶标-通路-疾病”网络，深入探索药物与疾病的关系，从而多层次地阐明药物的作用机制[9]。因此，笔者应用网络药理学的方法，揭示桃仁-红花药对治疗ONFH的作用机制，为其后续研究提供参考。
　　1 资料与方法
　　1.1 数据库与软件
　　中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：// ibts. hkbu. edu. hk/ LSP/ tcmsp.php）；反向分子对接服务器（DRAR- CPI，https：//cpi.bio-x.cn/drar/）；人类基因数据库（GeneCards，http：//www.genecards.org/）；蛋白质数据库（UniProt，http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；有机小分子生物活性数据库（Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；蛋白互作平台STRING数据库（https：//string- db.org/）；分子对接服务器（http：//www.x-mol.com）；在线《人类孟德尔遗传》数据库（OMIM，http：//omim.org/）；网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.6.0；生物学信息注释数据库（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）；在线云平台OmicShare网站（www.omicshare.com/tools）。
　　1.2 化学成分的收集与筛选
　　在TCMSP中分别以“桃仁”“红花”作为关键词进行检索，获取两种药物所含化学成分的相关信息，选取同时满足口服利用度（OB）>30%、类药性（DL）>0.18两个条件的成分作为活性成分[10]。然后通过Pubchem检索出每一个活性成分的3D结构，以.mol2格式保存。
　　1.3 活性成分作用靶标及ONFH作用靶标相应基因的获取
　　将检索得到的桃仁-红花药对活性成分的.mol2格式文件均上传至DRAR-CPI，并对活性成分与蛋白的作用强度进行打分。选取Z’-score<-0.5（表示活性成分与靶标有潜在结合的可能性）作为桃仁-红花药对活性成分的预测靶标，利用UniProt数据库检索得出桃仁-红花药对的药物靶标编号（PDB ID），再限定物种为“Human（人类）”，得到药物靶标对应的基因靶标。以“Osteonecrosis of the femoral head”或“ONFH”為关键词在GeneCards和OMIM中检索收集与ONFH相关的靶标基因，并与桃仁-红花药对的活性成分作用靶标基因进行比对，筛选出共同靶标基因。
　　1.4 活性成分-ONFH靶标网络的构建
　　将桃仁-红花药对的活性成分与ONFH作用靶标导入Cytoscape 3.6.0软件，构建其活性成分-ONFH靶标网络。网络中节点代表活性成分或作用靶标，边代表活性成分与靶标的相关性。
　　1.5 靶蛋白相互作用网络的构建
　　利用STRING数据库检索桃仁-红花药对与ONFH的潜在靶标，将物种设为“Human”（人类），设定最低相互作用阀值为中等置信度“Medium confidence” 0.4，其余参数保持默认设置，获取桃仁-红花药对治疗ONFH潜在靶标的相互作用关系，并导入Cytoscape 3.6.0软件绘制其蛋白相互作用（PPI）网络，然后使用Cytoscape 3.6.0软件中的Network Analyzer进行网络分析，并以连接度（Degree，表示在PPI网络里节点通过的边的数量；其值越大表明该节点与其他节点相互作用越重要）作为指标，调节节点的大小，绘制PPI网络图。
　　1.6 分子对接分析活性成分与靶蛋白的结合作用
　　基于上述PPI网络，筛选Degree值排名前5位的靶标，导入分子对接服务器与桃仁-红花药对的活性成分进行分子对接，并对分子对接结果的对接分数（Docking score）进行分析，预测、评价桃仁-红花药对活性成分与核心靶标之间的结合活性。当Docking score值>4.25时，表示分子与靶标具有一定的结合能力；>5.0时，表示结合能力较高；>7.0时，表示结合能力很高。 　　1.7 基因本体生物过程与京都基因与基因组百科全书通路富集分析
　　将桃仁-红花药对的作用靶标导入DAVID中，进行基因本体（GO）分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，得到通路富集结果，选取P<0.001生物过程和通路，并且按照富集基因数从大到小排序，选取排名前20的通路，使用OmicShare网站绘制通路信息图。检索相关文献，筛选可能与治疗ONFH相关的通路及潜在靶标，然后与桃仁-红花药对的活性成分构建出“活性成分-ONFH靶标- KEGG通路”的多维网络关系图。
　　2 结果
　　2.1 桃仁-红花药对活性成分分析
　　根据OB>30%，DL>0.18，筛选出桃仁-红花药对的活性成分44个（两者均含有β-谷固醇）。其中桃仁23个，包括杨树酚苷、常春藤皂苷元、菜油甾醇等；红花22个，包括木酚素、β-类胡萝卜素、黄芩苷、槲皮素等。桃仁-红花药对部分活性成分基本信息见表1（由于本文活性成分的名称过长，故以字母和数字的组合代替）。
　　2.2 桃仁-红花药对的靶标预测
　　通过DRAR-CPI查找桃仁-红花药对44个活性成分的靶标，得到Z’-score<-0.5的靶标2 322个。在UniProt中输入蛋白靶标的PDB ID，获得276个基因靶标。将所得基因靶标与OMIM与GeneCards中ONFH相关基因作比对，筛选出可能与ONFH有关的作用靶标78个。如核受体辅激活蛋白2（NCOA2）对应PBD ID为1IVT， β2型肾上腺素受体（ADRB2）对应PBD ID为3GEF等。
　　2.3 活性成分-ONFH靶标网络构建
　　在Cytoscape 3.6.0软件中导入桃仁-红花药对的活性成分与ONFH作用靶标，构建活性成分-靶标网络，见图1[图中六边形节点代表活性成分，如槲皮素（D37）等；圆形节点代表作用靶标，如血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）等]。
　　由图1可得，此网络共包括节点123个，边389个。不同的节点代表桃仁-红花药对的潜在活性成分与作用靶标。图中桃仁-红花药对中一个靶标可对应相同的活性成分，也可与不同的活性成分相对应，提示桃仁-红花药对治疗ONFH具有多成分、多靶标的特点。
　　2.4 靶蛋白相互作用网络分析
　　将桃仁-红花药对可能与ONFH相关的78个靶标导入STRING数据库获取的相互作用关系，使用Cytoscape 3.6.0软件绘制PPI网络图，结果详见图2。
　　由图2可得，此网络共包括节点78个，边582个。图中Degree值越大则节点越大。结果提示，桃仁-红花药对抗ONFH的靶标中Degree值最高的5个靶点为血管内皮生长因子（VEGF）、VEGI、急性C反应蛋白（CRP）、B细胞淋巴瘤2（BCL2）、成骨细胞特异性转录因子（RUNX2）。
　　2.5 分子对接结果
　　蛋白的Degree值代表与其有相互作用关系的蛋白数量。Degree值越大意味着该蛋白在桃仁-红花药对治疗ONFH中具有重要作用。本研究选取靶标相互作用网络中Degree排名前5的关键靶标做分子对接验证。在分子对接服务器中输入5个蛋白靶标的PDB ID，并与桃仁-红花药对44个活性成分进行对接，结果详见图3。
　　由图3可得，有26个Docking score值>7.0，其中白细胞介素6（IL-6）2个、肿瘤坏死因子（TNF）5个、VEGF 3个、内皮素1（EDN1）2个、转化生长因子β1（TGFB1）6个，由此可知，桃仁-红花药对的活性成分与靶标的结合能力较强。
　　2.6 GO和KEGG通路富集分析
　　对桃仁-红花藥对活性成分的对应靶标进行GO 和 KEGG 分析，以P<0.001为阈值筛选前20的GO生物过程与KEGG代谢通路，桃仁-红花药对治疗ONFH的GO生物过程见图4，桃仁-红花药对治疗ONFH的KEGG代谢通路见图5。
　　由图4、图5可知，桃仁-红花药对治疗ONFH的GO生物过程与凋亡过程负向调节、核转录因子κB活动的正向调节、以DNA为模板的转录正向调节、丝氨酸肽基磷酸化正向调节等相关；桃仁-红花药对治疗ONFH的KEGG代谢通路与分泌型糖蛋白（Wnt）信号通路、黑色素生成通路、VEGF信号通路、基底部细胞癌信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路等关系较为密切。
　　2.7 活性成分-ONFH靶标-KEGG通路网络构建
　　通过阅读文献在排名前20的KEGG通路中选出可能与ONFH相关的通路，并将其与桃仁-红花药对的活性成分、作用靶标一一对应，构建活性成分-ONFH靶标-KEGG通路多维网络图，详见图6。
　　由图6可知，桃仁-红花药对治疗ONFH涉及的活性成分共19个，如黄芩素、槲皮素、β-类胡萝卜素等，其作用的靶标主要有VEGF、VEGI、CRP、BCL2、RUNX2等39个；靶标主要涉及分泌型糖蛋白信号通路、VEGF信号通路等，表明桃仁-红花药对治疗ONFH涉及多成分、靶标及通路。
　　3 讨论
　　本研究共收集到桃仁-红花药对治疗ONFH的活性成分44个，可能与ONFH相关的作用靶标78个，提示桃仁-红花药对治疗股骨头坏死具有多成分、多靶标的特点，其PPI网络图也呈现出桃仁-红花药对与ONFH各蛋白靶标之间关系密切，提示其作用机制复杂多样，非单一蛋白靶标作用而成。分子对接分析结果显示，桃仁-红花药对的活性成分与各蛋白靶标之间结合能力较强，在此基础上进行网络分析结果可信度较高，参考价值较大。
　　活性成分-ONFH靶标-KEGG通路网络结果显示，桃仁-红花药对治疗股骨头坏死涉及Wnt信号通路、VEGF信号通路、AMPK信号通路、核转录因子κβ受体活化因子-核转录因子κB受体活化因子配体-骨保护素（RANK-RANKL-OPG）信号通路等。Wnt信号通路是胚胎发育与细胞凋亡调控的一条重要通路[11]，在骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞以及成骨细胞的增殖分化过程中起调节作用[12]。相关研究发现，黄芩苷可通过调控Wnt信号通路以促进骨髓间充质干细胞的分化与成熟[13]。此外，有研究发现，黄芩苷在一定干预时间与药物浓度内，可随其干预时间的延长和药物浓度的增加而使OPG mRNA的表达增强、RANKL mRNA的表达减弱，进而调节RANK-RANKL-OPG信号通路[14-16]。VEGF是血管形成的主要刺激因子，与ONFH的发生相关，能抑制骨细胞程序性死亡，促进骨细胞生成，修复坏死的骨组织，改善预后[17-19]。AMPK信号通路中的AMPK同样在骨组织的生理活动中发挥重要作用[20]。相关研究发现，槲皮素可作用于人体内的VEGF、AMPK信号通路，通过相关通路影响ONFH的发生发展[21-23]。综上，笔者推测桃仁-红花药对主要通过影响骨髓间充质干细胞分化以及调节成骨细胞与破骨细胞的生理活动以达到治疗ONFH的目的。 　　本研究结果表明，桃仁-红花药对治疗ONFH的过程涉及了多个活性成分、作用靶标及生物过程，但本研究只是在分子机制上进行的预测探讨，具体药物作用机制仍需进一步实验进行验证。
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　　（收稿日期：2018-09-05 修回日期：2019-01-02）
　　（编辑：唐晓莲）
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