基于网络药理学的羌活—独活药对抗炎作用机制研究

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　　摘 要 目的：预测羌活-独活药对抗炎活性成分及其作用机制。方法：根据口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18的原则分别筛选羌活、独活的活性成分，通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）对羌活、独活的潜在作用靶点进行預测和筛选，然后以“Anti-inflammatory”为关键词在人类基因数据库Genecards中检索炎症相关靶基因，并与羌活、独活中活性成分靶基因映射筛选出共同靶点，再利用Cytoscape 3.5.1软件建立活性成分-靶点网络。将筛选得到的靶点在相互作用基因/蛋白质搜索工具平台STRING V 10.5构建其靶蛋白相互作用（PPI）网络，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路和基因本体（GO）富集分析，以研究其抗炎机制。结果：从羌活、独活药对中共筛选得到香豆素、β-谷甾醇、欧前胡素、紫花前胡苷等15个活性成分，作用于转录因子AP-1、磷脂酰肌醇激酶3r亚基、雌激素受体等49个靶点，主要涉及乙型肝炎、细胞凋亡等19条信号通路，参与炎症反应调节、前列腺素类生物合成等47个生物过程。结论：预测了羌活-独活药对活性成分多靶点、多通路、多生物过程的抗炎机制，为其进一步的抗炎机制研究指明了方向。
　　关键词 羌活；独活；药对；抗炎机制；靶蛋白相互作用；信号通路
　　Study on Anti-inflammatory Mechanism of Couplet Medicine of Notopterygium incisum-Angelica pubescens Based on Network Pharmacology
　　DUAN Kaixuan1，LI Yuewen1，LIU Hebo2，WANG Bolong1（1.School of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China；2.School of Medicine， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To predict the anti-inflammatory active components and mechanism of couplet medicine of Notopterygium incisum-Angelica pubescens. METHODS： According to the principle of oral bioavailability≥30% and drug- likeness≥0.18， active components of N. incisum and A. pubescens were screened； TCMSP was used to predict and screen the potential target of them. Using “Anti-inflammatory” as keyword， inflammatory related target genes were retrieved from human gene database Genecards. Common target was screened by mapping the target genes of active ingredients from couplet medicine of N. incisum-A. pubescens. The active ingredient-target network was established by using Cytoscape 3.5.1 software. The screened targets were used to construct the target protein interaction （PPI） network on the STRING V 10.5 platform. Its anti-inflammatory mechanism was studied by KEGG signaling pathway and GO biological enrichment analysis. RESULTS： Totally 15 active components such as coumarin， beta-sitosterol， ammidin， nodakenin were selected from couplet medicine of N. incisum-A. pubescens. Acting on 49 targets such as transcription factor AP-1， PI3-kinase subunit gamma， estrogen receptor， they mainly involved 19 signaling pathways such as hepatitis B and cell apoptosis， and were involved in 47 biological processes such as regulating inflammatory response and prostaglandin biosynthesis. CONCLUSIONS： The anti-inflammatory mechanism of active components of couplet medicine of N. incisum-A. pubescens on multi-target， multi-channel and multi-biological processes is predicted， and it points out the direction for further anti-inflammatory mechanism study. 　　KEYWORDS Notopterygium incisum； Angelica pubescens； Couplet medicine； Anti-inflammatory mechanism； Target protein interaction； Signaling pathway
　　羌活與独活配伍始于唐《外台秘要》之宣痹汤[1]，二药合用属于七情中的相须相助[2]，可散风除湿、通络止痛，用于治疗风寒湿痹。已故名老中医焦树德善用羌活-独活药对治疗类风湿性关节炎，认为羌活散寒祛风、胜湿止痛行气分，主治上肢痹症；独活祛风除湿、解表止痛行血分，善攻下肢痹症。二药相须为用，气血双调，上下同治，相互为用，可增强治疗痹证之疗效[3]。名医孙曼之用羌活、独活等治疗感受风邪所致咳嗽、鼻塞、流浊涕以及下肢水肿、腰背疼痛等证疗效显著[4]。刘晨等[5]研究发现，羌活-独活药对及其单味药对弗氏完全佐剂诱导的关节炎模型大鼠有一定的改善作用，且药对作用优于单药。虽然临床上羌活-独活联用治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎等炎性疾病疗效明确，但是其具体作用机制尚不清楚。
　　网络药理学由英国邓迪（Dundee）大学的药理学家于2007年首次提出[6]，并阐述为“下一代药物研究范式”。近年来，随着系统生物学、多向药理学、生物信息学、计算机技术等学科的快速发展与融合，网络药理学作为药物研究的新模式已经从理论发展到了实践。其以“疾病-基因-靶点-药物”多层次、多角度的相互作用网络为理念，挖掘药学数据库、生物学数据库、疾病数据库等多种数据库的海量信息，运用专业的可视化网络分析软件及算法进行大数据综合分析，从网络层面系统综合地观察药物如何干预和影响疾病网络，从而揭示复杂药物协同作用于人体的机制。其整体性、系统性的特点与中医药整体观、辨证论治、组方配伍的原则不谋而合，在中医药药效物质基础[7]、作用机制[8]、新药研发[9]、新适应证[10]、配伍规律[11]等方面展现出了巨大潜力，解决了实验研究周期长、费用高、低通量、盲目性等诸多弊端，已成为中医药复杂体系研究的新机遇、新利器。故本研究拟借助网络药理学方法，全面、系统地分析羌活-独活药对的成分、靶点、通路之间的网络关系，旨在为阐明其抗炎的药效物质及作用机制提供理论参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 数据库与软件
　　中药系统药理学分析平台（TCMSP，http；//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；通用蛋白质数据库UniProt（http：//www.uniprot. org/uploadlists/）；人类基因数据库Genecards（http：//www.genecards.org/）；蛋白质互作平台STRING V 10.5（https：//string-db.org/）；生物学信息注释数据库DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）；网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.5.1（http：//cytoscape.org/）。
　　1.2 活性成分的选取
　　利用TCMSP平台，根据口服生物利用度（OB）≥ 30%和类药性（DL）≥0.18的原则收集羌活、独活两味中药的化学成分[12]，再结合文献报道最终确定其活性成分，统一保存为.mol2格式文件。
　　1.3 靶点筛选及活性成分-靶点网络构建
　　通过TCMSP平台收集羌活、独活的潜在作用靶点，利用蛋白质数据库UniProt转换成对应的基因名称，在人类基因数据库Genecards中以“Anti-inflammatory”为关键词，检索炎症相关靶基因，并与羌活、独活药对中活性成分靶基因映射筛选出共同靶点，确定为药对活性成分的抗炎靶点。最后采用Cytoscape 3.5.1软件建立活性成分-靶点网络（在该网络中，节点代表化合物、靶蛋白，边代表化合物-靶点的相互作用）。
　　1.4 靶点相互作用研究
　　为明确羌活-独活药对抗炎靶点之间的相互作用，将筛选得到的靶点在STRING平台构建其靶蛋白相互作用（PPI）网络（图中节点代表蛋白，线代表互作关系）。设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等“Medium confidence”，其他参数保持默认设置。将PPI网络图导入Cytoscape 3.5.1软件进行拓扑属性分析。借助“Network analyzer”功能，计算参与互作靶蛋白的度值（Degree）和介数（Betweenness），选取Degree和Betweenness 同时在平均数之上的靶标作为关键靶标，以明确药对作用的主要靶点（PPI中度值反映了一个节点与其他节点的连接数目，介数是网络中所有最短路径中经过该节点的路径的数目占最短路径总数的比，度值和介数是量化一个节点在网络中重要性的主要拓扑参数）[13]。
　　1.5 京都基因与基因组百科全书代谢通路富集分析
　　利用生物学信息注释数据库DAVID V 6.8进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析，物种与背景设置均为“Homo sapiens”（智人），以P<0.05为标准，研究靶点投射各通路中的个数及其在每个通路蛋白中的占比（百分率），明确其抗炎的主要信号通路。
　　1.6 基因本体生物过程富集分析
　　通过Cytoscape 3.5.1软件中的“BiNGO”插件对关键靶点进行基因本体（GO）生物过程富集分析（以P<0.05为标准判断相关），建立GO生物过程层级关系图，分析靶点在体内可能参与的生物过程，并用“MCODE”插件对不同的生物过程进行聚类分析（MCODE是以节点赋权重、模块预测以及可选的后期处理为步骤的，基于密度的局部搜索聚类算法，可将不同类别GO生物过程分为不同的子簇，同一子簇下的GO生物过程具有相似的功能特性，用以探究各子簇代表的主要GO生物过程及其药理意义）。 　　2 结果
　　2.1 主要活性成分选取结果
　　根据OB≥30%和DL≥0.18的原则筛选药效成分，虽然部分成分（如结晶乙酸柏木酯、亚油酸甲酯等）未达标，但是这些成分在药材中含量较高，加上较多文献[14-16]均报道其具有明显的药理作用，因此将这些成分也纳入到后续研究中，最终筛选出了15个化学成分。羌活、独活药材中活性成分及参数详见表1。
　　2.2 靶点筛选及成分-靶点网络图构建结果
　　通过TCMSP平台共找得170个靶蛋白，将这些靶蛋白转化成对应的基因。将170个靶基因与 Genecards数据库挖掘到的8 561个抗炎相关基因映射后，得到共同靶基因49个，即为羌活-独活药对抗炎作用靶点。运用Cytoscape 3.5.1软件以15个活性成分及49个靶基因建立的活性成分-靶点网络图中，共有64个节点、143条边，充分体现了羌活-独活多成分、多靶点的作用机制。羌活-独活药对活性成分-作用靶点网络图见图1。
　　2.3 靶点PPI 网络分析结果
　　PPI网络中实际包含47个节点（2个靶点未参与 PPI网络构建）和189条相互作用连线。PPI 网络平均Degree为8.04，平均Betweenness为3.1×10-2，Degree、Betweenness均超过平均值的靶点共有11 个，即这11个靶点为羌活-独活药对发挥抗炎药效作用的关键靶点。羌活-独活药对靶点PPI网络图见图2，关键靶点的拓扑参数见表2。
　　2.4 KEGG代谢通路分析结果
　　符合P<0.05且与炎症密切相关的信号通路包括乙型肝炎（Hepatitis B）、细胞凋亡（Apoptosis）等19条。其中乙型肝炎信号通路与炎症的发生密切相关（P值最小），故以其为例观察药对活性成分作用靶点在该通路中的富集情况。结果发现，羌活-独活药对活性成分可作用于该通路中的JUN、CAPS3、CAPS8、CAPS9、PIK3CG、BAX、CDK2、TGFB1等靶点，发挥抗炎作用。抗炎作用靶点KEGG代谢通路统计结果见表3，乙型肝炎信号通路图见图3。
　　2.5 GO生物富集过程分析结果
　　羌活-独活药对靶点GO生物过程富集得到293个生物过程。按照MCODE聚类分析算法得到47个子簇，其中与抗炎密切相关的子簇包括细胞凋亡、细胞迁移与新生血管生成、炎症反应、T细胞反应、白细胞反应、病毒调控、皮质类固醇刺激的反应、5-羟色胺分泌的负调节、前列腺素类生物合成、淋巴调控等10个子簇。GO生物过程层级关系见图4，子族注释及中心GO生物富集过程见表4。
　　3 讨论
　　羌活-独活是治疗类风湿性和风湿性关节炎的主要药对，但其具体药效成分并不清楚。本研究根据OB、DL以及文献挖掘纳入了15种成分，其中实验研究已明确证实的抗炎成分有香豆素、β-谷甾醇、欧前胡素和紫花前胡苷。如独活香豆素有可能通过降低大鼠血清白细胞介素1α（IL-1α）、IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子的表达，对帕金森病起到保护作用[16]；β-谷甾醇与阿司匹林联合使用比单独使用阿司匹林的抗炎效果更强[17]。胡荣等[18]通过耳肿胀法、足肿胀法、腹腔毛细血管法证实了欧前胡素通过降低前列腺素E2（PEG2）、IL-1以及TNF-α浓度发挥抗炎作用；熊友谊等[19]发现，紫花前胡苷能显著下调哮喘模型小鼠 IL-4、IL-5、IL-13等炎性因子水平，抑制气道炎性反应，其余活性成分的抗炎作用还有待于实验进一步确认。
　　PPI分析结果显示，JUN、PIK3CG、ESR1、NOS、PTGS2等是羌活-独活抗炎的关键靶点，而研究证实上述靶点与炎症的发生发展密切相关。如JUN是哺乳动物细胞内AP-1亚单位之一；而AP-1是位于JNK下游的关键信号蛋白分子，JNK受刺激后，可激活JUN，使其磷酸化，从而使炎症转录启动并增强，导致炎症持续和发展[20]。PIK3CG编码蛋白属于磷脂酰肌醇3-激酶 （PI3K） 的一个亚型， 主要表达在白细胞和心血管系统，在炎症过程中扮演着重要作用[21]。研究发现[22]，人内皮细胞上ESR1激活后能减少炎症介质TNF-α介导的促炎症细胞黏附分子产生，从而抑制炎症反应。NOS3又称eNOS，是内皮型一氧化氮合酶，能够催化血管内皮细胞合成一氧化氮（NO），而NO在免疫反应及炎症反应中发挥重要作用，如NO可通过调节炎症信号和调节树突状细胞的生命周期而表现出抗炎作用[23]。PTGS2是前列腺素合成过程中的关键酶，而前列腺素是一种重要的炎症介质，参与机体炎症反应。Ban HS等[24]发现，欧前胡素能够抑制大鼠腹膜巨噬细胞中前列腺素的产生，同时还能抑制环氧酶2和前列腺素E合成酶产生，从而发挥抗炎作用。
　　KEGG代谢通路及GO生物过程富集结果显示，羌活-独活药对靶点参与多条抗炎镇痛通路，如乙型肝炎、细胞凋亡等，涉及病毒调控、白细胞反应、淋巴调控等炎症生物过程。有研究也發现，欧前胡素能够调控水泡性口腔炎病毒假型或糖蛋白gpl60包膜的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型对T细胞和HeLa细胞的感染[25]。另有研究表明[26]，羌活能显著抑制弗氏完全佐剂所致的大鼠足肿胀，这与其调控大鼠全血白细胞吞噬功能以及淋巴细胞转化有关。
　　综上所述，本研究应用网络药理学方法，对羌活-独活药对的活性成分、靶点以及通路间的复杂关系进行了分析，初步揭示了其通过影响细胞迁移与凋亡、调节免疫反应，抑制炎症因子产生，从而发挥抗炎效应，这为对其做进一步的抗炎机制实验研究指明了方向。
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　　（收稿日期：2018-12-31 修回日期：2019-03-27）
　　（编辑：林 静）
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