炎宁糖浆质量标准研究

作者:未知

   摘要:目的  提高炎宁糖浆的质量标准,有效控制制剂质量。方法  采用薄层色谱法对炎宁糖浆中白花蛇舌草、鹿茸草进行定性鉴别,采用HPLC测定去乙酰车叶草酸甲酯的含量,建立HPLC指纹图谱分析方法。结果  薄层色谱鉴别分离度高、专属性强、重现性好;含量测定指标去乙酰车叶草酸甲酯在0.08~0.8 μg范围内呈良好的线性关系(r=1.000),平均回收率为104.68%,精密度RSD=0.89%,重复性RSD=0.55%;经采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对指纹图谱进行分析,标定了33个共有峰,确认4个峰分别为原儿茶酸、去乙酰车叶草酸甲酯、香草酸、咖啡酸,对10批炎宁糖浆进行相似度评价,其相似度均高于0.85。结论  本方法简单准确、专属性强,可为提高炎宁糖浆质量标准提供依据。
  关键词:炎宁糖浆;白花蛇舌草;鹿茸草;去乙酰车叶草酸甲酯;薄层色谱法;高效液相色谱法;指纹图谱
  中图分类号:R284.1    文献标识码:A    文章编号:1005-5304(2019)05-0083-05
  DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.018 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
  Abstract: Objective To improve the quality standard of Yanning Syrup and control the qulity of preparation. Methods The thin-layer chromatography method was used to conduct qualitative identification for Hedyotis diffiisa and Monochasma sheareri in Yanning Syrup. HPLC was used to measure the content of deacetyl asperulosidic acid methyl ester. The HPLC fingerprint analysis method was established. Results The method of the thin layer chromatographic condition was good enough. And the method was special and reproducible. The linear of deacetyl asperulosidic acid methyl ester was in the range of 0.08–0.8 μg (r=1.000). The average recovery rate was 104.68%, RSD of precision was 0.89%, RSD of reproducibility was 0.55%. Besides, Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of TCM was used to analyze and compare the fingerprints. Totally 33 common peaks were determined and four were calibrated including protocatechuic acid, deacetyl asperulosidic acid methyl ester, vanillic acid and caffeic acid. The similarity were all over 0.85 for 10 batches of Yanning Syrup. Conclusion The method is simple, accurate and specific, which can provide a reasonable basis for the improvement of quality standard of Yanning Syrup.
  Keywords: Yanning Syrup; Hedyotis diffiisa; Monochasma sheareri; deacetyl asperulosidic acid methyl ester; TLC; HPLC; fingerprints
  炎寧糖浆由鹿茸草、白花蛇舌草、鸭跖草3味药组成,具有清热解毒、消炎止痢功效。鹿茸草为玄参科植物沙氏鹿茸草的干燥地上部分,收载于2008年版《上海市中药饮片炮制规范》[1],含有苯乙醇苷、黄酮、有机酸及多糖等成分[2],具有清热解毒、凉血止血、除湿止痛、抑菌抗炎、抗癫痫及保护心肌的功效[3-4]。白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草的干燥全草,收载于2012年版《黑龙江省中药饮片炮制规范与标准》[5],含有萜类、黄酮、多糖、生物碱及氨基酸等成分[6],具有清热解毒、散结消痛、抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化的功效[7-8]。鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草的干燥地上部分,收载于2015年版《中华人民共和国药典》(一部)[9],具有清热消炎、抗病毒、镇痛、抗高血糖及抑菌的功效[10-11]。炎宁糖浆现收载于2015年版《中华人民共和国药典》(一部),鉴别项为化学反应法和以熊果酸为对照的薄层鉴别法,含量测定为紫外分光光度法测定总黄酮含量[9]。现行标准在实际薄层鉴别中熊果酸与齐墩果酸难以分离,含量测定采用紫外可见分光光度法测定总黄酮干扰项较多。为更有效控制制剂质量,本试验修改白花蛇舌草的薄层色谱鉴别,并增加鹿茸草的薄层色谱鉴别,采用HPLC测定白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量,以咖啡酸为参照峰,建立HPLC指纹图谱分析方法。   1  仪器与试药
  1260型HPLC仪,包括DAD检测器(美国Agilent公司);2695型HPLC仪,包括2998PDA检测器(美国Waters公司);XS205型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);DXA252薄层色谱数码成像系统(杭州汉泽科技有限公司);Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm),Venusil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm),Kiomosil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm);TLC用硅胶G板(青岛海洋化工厂);聚酰胺薄膜(台州市路桥四甲生化塑料厂)。
  炎宁糖浆,黑龙江康隆药业有限公司,批号分别为1610001、1610002、1610003、1607001、1607002、1607003、1701003、1701004、1704001、1701001,依次编号为S1~S10;白花蛇舌草、鹿茸草、鸭跖草,黑龙江康隆药业有限公司,批号160701,经黑龙江省食品药品检验检测所笔雪艳鉴定为白花蛇舌草、鹿茸草、鸭跖草正品;白花蛇舌草对照药材(批号121028- 200507)、咖啡酸對照品(批号110855- 201210)、原儿茶酸对照品(批号110809-200604)、芦丁对照品(批号100080-201408)、去乙酰车叶草酸甲酯对照品(批号111786-201602),中国食品药品检定研究院;乙腈、甲醇为色谱纯,美国Honeywell公司;乙醇、氯仿、冰醋酸为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;超纯水,自制。
  2  方法与结果
  2.1  定性鉴别
  2.1.1  白花蛇舌草
  取炎宁糖浆10 mL,加硅藻土适量拌匀,干燥,加乙醇30 mL,静置12 h,过滤,滤液浓缩至约2 mL,制成供试品溶液。取白花蛇舌草对照药材1 g,加水30 mL,加热回流1 h,放冷,过滤,滤液浓缩至约15 mL,加乙醇30 mL,静置12 h,过滤,滤液浓缩至约2 mL,制成对照药材溶液。按处方量折算制成缺白花蛇舌草的炎宁糖浆,同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法[2015年版《中华人民共和国药典》(四部)通则0502]试验,吸取上述供试品溶液10 μL、对照药材溶液5 μL、阴性对照溶液10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(5∶1.5∶0.1)的下层溶液为展开剂展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
  2.1.2  鹿茸草
  取炎宁糖浆5 mL,加水20 mL稀释,用乙酸乙酯萃取4次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。按处方量折算制成缺鹿茸草的炎宁糖浆,同法制成阴性对照溶液。称取咖啡酸对照品适量,加甲醇制成1 mg/ mL的对照品溶液。照薄层色谱法[2015年版《中华人民共和国药典》(四部)通则0502]试验,吸取上述溶液各2 μL,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以36%乙酸为展开剂展开,取出,晾干,置紫外灯光下(365 nm)检视。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。
  2.2  含量测定
  2.2.1  色谱条件与系统适用性
  色谱柱:Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相:乙腈-水(4∶96,V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:237 nm;进样量:5 μL。在上述色谱条件下,以去乙酰车叶草酸甲酯峰计理论塔板数≥8000,分离度>1.5。色谱图见图1。
  2.2.2  对照品溶液的制备
  取去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量,精密称定,加4%乙腈制成含去乙酰车叶草酸甲40 μg/mL的溶液,即得。
  2.2.3  供试品溶液的制备
  取炎宁糖浆5 mL,置于25 mL容量瓶中,加水定容,摇匀,过滤,取续滤液,即得。
  2.2.4  阴性对照溶液的制备
  按处方量并以相同制剂工艺制备缺白花蛇舌草的阴性样品,按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。
  2.2.5  线性关系考察
  精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液2、5、10、15、20 μL,按“2.2.1”项下色谱条件测定,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=7.237 5X-3.200 0(r=1.000),去乙酰车叶草酸甲酯在0.08~0.8 μg范围内线性关系良好。
  2.2.6  重复性试验
  取同一批样品(批号1607001),按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行测定并计算含量,去乙酰车叶草酸甲酯峰面积RSD=0.55%,表明本法重复性较好。
  2.2.7  精密度试验
  取去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积,去乙酰车叶草酸甲酯峰面积RSD=0.89%,表明本方法精密度良好。
  2.2.8  稳定性试验
  按“2.2.3”项下方法平行制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、16、24 h测定,去乙酰车叶草酸甲酯峰面积RSD=1.34%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
  2.2.9  加样回收率试验
  精密量取已知含量的炎宁糖浆(批号1607001)供试品6份,每份2.5 mL(含去乙酰车叶草酸甲酯0.367 1 μg),精密加入去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液适量,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行测定,计算回收率,结果见表1。   2.2.10  耐用性试验
  考察不同品牌十八烷基键合硅胶色谱柱(Aglilent C18、Kiomosil C18、Venusil C18)、柱温对色谱图的影响。按“2.2.1”项下色谱条件对供试品溶液和对照品溶液进行测定,记录色谱图,结果样品色谱峰分离度、理论塔板数均能满足要求,耐用性良好。
  2.2.11  样品含量测定
  按上述方法制备供试品溶液,测定10批炎宁糖浆中去乙酰车叶草酸甲酯含量,每批平行测定2份,结果见表2。
  2.3  指纹图谱
  2.3.1  色谱条件
  色谱柱:Venusil C18(4.6 mm×100 mm,5 ?m);流动相:乙腈(A)-0.5%乙酸水溶液(B),梯度洗脱(0~4 min,0%A;4~25 min,0~13%A;25~30 min,13%A;30~40 min,13%~17%A;40~62 min,17%~36%A;62~80 min,36%~57%A);流速:0.9 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:250 nm(0~40 min),350 nm(40.1~60 min),250 nm(60.1~80 min);进样量5 μL。
  2.3.2  对照品溶液的制备
  精密称取咖啡酸对照品适量,加甲醇配制成含咖啡酸0.2 mg/mL对照品溶液;精密称取去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量,加4%乙腈制成含去乙酰车叶草酸甲酯40 μg/mL对照品溶液;精密称取原儿茶酸对照品适量,加70%甲醇配制成含原儿茶酸0.1 mg/mL对照品溶液;精密称取香草酸对照品适量,加70%甲醇配制成含原儿茶酸0.2 mg/mL对照品溶液。
  2.3.3  供试品溶液的制备
  精密量取本品5 mL,加水定容至50 mL容量瓶中,摇匀,0.45 ?m微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。
  2.3.4  精密度试验
  取同一批供试品溶液(批号167001),按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次测定,记录色谱图,以咖啡酸色谱峰为参照峰,对各共有峰相对保留时间及相对峰面积进行计算,并利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算相似度。结果相对保留时间RSD为0.02%~0.30%,相对峰面积RSD为0.3%~2.56%,均小于3.0%,表明本方法精密度良好。
  2.3.5  稳定性试验
  取同一批供试品溶液(批号167001),按“2.3.1”项下色谱条件,分别于0、2、4、6、8、12、18、24进样测定,各主要色谱峰相对保留时间RSD为0.02~0.22%,相對峰面积RSD为0.49%~2.86%,均小于3.0%。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算相似度,结果稳定性相似度均大于0.98,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
  2.3.6  重复性试验
  取平行制备的同一批号炎宁糖浆(167001)6份,按“2.3.1”项下色谱条件测定,记录色谱图。结果主要色谱峰的相对保留时间RSD为0.02%~0.23%,均小于2.0%;相对峰面积RSD为0.53%~4.70%。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》计算相似度,结果重复性相似度均大于0.98,表明本方法重复性良好,符合指纹图谱的要求。
  2.3.7  共有峰及参照色谱峰的建立
  取10批炎宁糖浆样品,按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液,并取咖啡酸、去乙酰车叶草酸甲酯、原儿茶酸、香草酸对照品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进行分析,得到各样品HPLC指纹图谱,结果见图2。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件确定了33个共有峰,并计算其相似度,结果见表3。利用对照品比对进行共有峰指认,通过对比保留时间和DAD光谱图,确认13号峰为原儿茶酸,14号峰为去乙酰车叶草酸甲酯,20号峰为香草酸,21号峰为咖啡酸,其中咖啡酸峰分离度好、响应值适中、相对峰面积较大,故以咖啡酸作为参照色谱峰。
  3  讨论
  本研究在炎宁糖浆原质量标准基础上,增加了白花蛇舌草和鹿茸草的专属性鉴别,以及对白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量测定。去乙酰车叶草酸甲酯为白花蛇舌草主要的萜类成分之一,具有紫外吸收,易于检测,且在常用中药中均未发现,因此选去乙酰车叶草酸甲酯作为质量控制的指标性成分有较好的专属性[12]。
  白花蛇舌草对照药材的薄层色谱鉴别,分别考察了三氯甲烷-乙醚(5∶1)、三氯甲烷-甲醇-水(5∶1.5∶0.5)、三氯甲烷-乙醇-浓氨试液(7.5∶7.5∶0.1)等多个展开系统,最终确定了三氯甲烷-甲醇-水(5∶1.5∶0.5)为展开剂的薄层色谱条件。
  鹿茸草含有大量咖啡酸,在鹿茸草的薄层色谱鉴别中,考察了乙酸丁酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5)、36%乙酸展开系统,后者的展开效果明显优于前者。此外,将鹿茸草水煎液按“2.1.2”项下方法制备,供试品与鹿茸草在相应位置上有多个相同颜色斑点,且无阴性干扰。但由于无市售的鹿茸草对照药材,故仍将咖啡酸鉴别定为鹿茸草的鉴别方法。
  去乙酰车叶草酸甲酯的含量测定试验中,经DAD全波长扫描,在237 nm具有最大吸收波长,因此确定检测波长为237 nm。根据去乙酰车叶草酸甲酯的理化性质和色谱行为,考察了水溶解、水饱和正丁醇萃取、乙酸乙酯萃取、D101大孔树脂洗脱制成供试品溶液,结果表明,水直接稀释的供试品溶液保留时间适中、分离度好且峰面积较大,为保证样品含量测定结果的真实有效性,最终选择水溶解进样。
  在炎宁糖浆指纹图谱研究中,本研究对乙腈- 0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%乙酸水溶液、乙腈-0.5 %乙酸溶液作为流动相体系进行了考察,结果表明,应用乙腈-0.5%乙酸水溶液系统洗脱可使炎宁糖浆样品得到较好的分离。分别于流速0.8、0.9、1.0 mL/min条件下对炎宁糖浆样品的指纹图谱进行测定,结果显示,流速为0.9 mL/min时,各成分分离效果较好,基线较平稳,故选择流速为0.9 mL/min。   参考文献:
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  (收稿日期:2018-08-29)
  (修回日期:2018-09-19;编辑:陈静)
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