芪贞降糖颗粒质量标准研究

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　　[摘要] 目的 建立芪貞降糖颗粒的质量标准。 方法 采用薄层色谱法（TLC）对芪贞降糖颗粒中的黄芪进行定性鉴别；采用高效液相色谱（HPLC）法对芪贞降糖颗粒中的枸橼酸、特女贞苷进行定量测定。色谱柱分别为Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相分别为0.1%磷酸水溶液、甲醇-水（36∶64），检测波长分别为210、224 nm，进样量分别为5.0、10.0 μL，柱温均为30℃，流速均为1.0 mL/min。 结果 黄芪药材的TLC特征斑点清晰，分离度好，阴性没有干扰；HPLC测得枸橼酸、特女贞苷分别在0.098 28～24.57 μg （r = 1.0000）、0.022 08～11.04 μg（r = 1.0000）范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率分别为100.18%、96.08%（n = 9），且RSD分别为2.3%、2.8%，枸橼酸、特女贞苷平均含量分别为46.9、1.02 mg/g。综合考虑，暂定每袋芪贞降糖颗粒中枸橼酸含量不低于400 mg，特女贞苷含量不低于12 mg。 结论 该方法准确、简便、重复性良好，能够很好地对芪贞降糖颗粒进行质量控制。
　　[关键词] 芪贞降糖颗粒；质量标准；枸橼酸；特女贞苷；高效液相色谱法；薄层色谱法
　　[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0033-05
　　Study on quality standard of Qizhen Jiangtang Granules
　　QIAN Cheng1，2，3 DING Liyu4 WANG Huanqing4 ZHANG Dan5 WU Fei1，2 FENG Yi1，2
　　1.Innovative Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2.Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine， Ministry of Education， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai， 201203， China； 3.Department of Pharmacy， Huadong Hospital Affiliated to Fudan University， Shanghai 200040， China； 4.Department of Pharmacy， Yueyang Hospital of Integrative Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China； 5.Department of Endocrinology， Yueyang Hospital of Integrative Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200437， China
　　[Abstract] Objective To establish the quality standard for Qizhen Jiangtang Granules. Methods Astragali Radix were identified by thin layer chromatography （TLC）. The contents of citric acid and specnuezhenide were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The columns were Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 mm×250 mm， 5 μm） and Kromasil 100-5 C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with 0.1%phosphoric acid-water、methanol-water（36∶64）as the mobile phases， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelengths were 210 nm， 224 nm， the column temperature was 30℃ and the injection volumes were 5.0， 10.0 μL. Results TLC spots of Astragali Radix were clear with good resolution and without interference of negative samples. HPLC showed that the citric acid and specnuezhenide had good linear relationship with peak area in the range of 0.098 28-24.57 μg （r = 1.0000） and 0.022 08-11.04 μg （r = 1.0000） respectively. The average sample recovery rates were 100.18%， 96.08% （n = 9）， and the RSD were 2.3% and 2.8%， respectively. The average contents of citric acid and specnuezhenide were 46.9， 1.02 mg/g， respectively. Considering comprehensively， the contents of citric acid and specnuezhenide in each bag is not less than 400 mg and 12 mg respectively. Conclusion The method is accurate， simple and reproducible， and can control the quality of Qizhen Jiangtang Granules. 　　[Key words] Qizhen Jiangtang Granules； Quality standard； Citric acid； Specnuezhenide； High performance liquid chromatography； Thin layer chromatography
　　芪贞降糖方由制乌梅、灵芝、黄芪和制女贞子4味中药组成，临床应用10余年，是用于治疗糖调节异常和2型糖尿病的临床验方，在改善患者胰岛素抵抗、调节糖代谢等方面疗效显著[1-6]。有研究[6-7]表明，枸櫞酸和特女贞苷是处方酸甘化阴的主要活性成分。本课题组前期[8-9]对该制剂中热敏性成分浓缩工艺进行研究时，初步建立溶液中特女贞苷和枸橼酸含量测定的高效液相色谱（HPLC）法，但未进行系统的方法学考察。为有效控制芪贞降糖颗粒质量、确保临床疗效，除常规项目外，本研究建立了黄芪成分的薄层色谱（TCL）鉴别法，并采用HPLC法测定芪贞降糖颗粒中枸橼酸和特女贞苷的含量，以期有效控制制剂的质量。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　Agilent 1200型高效液相色谱仪（VWD检测器，美国安捷伦科技有限公司）、Linomat 5型半自动点样仪联TLC visualizer成像系统（瑞典CAMAG公司）、XP205型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多科技有限公司）、FA2104N型分析天平（0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司）、Milli-Q型超纯水机（密理博中国科技有限公司）。
　　1.2 试药
　　枸橼酸对照品（批号：100396-201302）、特女贞苷对照品（批号：111926-201404）、黄芪对照药材（批号：121462-201304）均购自中国食品药品检定研究院；制乌梅（批号：150826，产地：浙江）、灵芝（批号：151201，产地：山东）、黄芪（批号：151112，产地：甘肃）、制女贞子（批号：151017，产地：湖南）均购自上海康桥中药饮品有限公司；硅胶G薄层板，购自烟台市化学工业研究所；水为超纯水；乙醇、磷酸等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。芪贞降糖颗粒中试产品（批号：1606001、1606002、1606003，规格：20 g/袋），委托上海市宝龙药业有限公司加工生产；阴性样品为自制样品。
　　2 方法与结果
　　2.1 黄芪的TLC鉴别
　　供试品溶液：将20 mL氨试液∶甲醇（1∶9）溶液加入研细后的4.0 g芪贞降糖颗粒（批号：1606001）中，超声处理30 min，滤过，滤液水浴蒸干后以0.5 mL甲醇复溶，即得。
　　对照药材和缺黄芪的阴性样品溶液：取黄芪对照药材0.6 g及按处方比例制备的芪贞降糖颗粒阴性样品（缺黄芪），分别按供试品溶液制备方法处理，即得对照药材和缺黄芪的阴性样品溶液。
　　取上述3种样品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）下层溶液展开，以10%硫酸乙醇溶液显色，并于105℃加热至斑点显色清晰，置于紫外灯（365 nm）下检视。供试品与对照药材在相应的色谱位置上显同色荧光斑点，阴性对照样品无干扰。见图1（封四）。
　　2.2 枸橼酸含量测定
　　2.2.1 色谱条件与系统适用性 Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸水溶液，柱温30℃，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm，进样体积为5.0 μL[12-14]。
　　2.2.2 对照品溶液制备 精密称取枸橼酸对照品49.14 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成浓度为4.914 mg/mL的溶液，并精密吸取1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为0.4914 mg/mL的枸橼酸对照品溶液。
　　2.2.3 供试品溶液制备 取芪贞降糖颗粒（批号：16060 01）0.25 g，精密称定，加水25 mL，超声5 min，冷却，水补足减失重量，摇匀，12 000 r/min，高速离心10 min，离心半径5.8 cm，取上清液，即得。
　　2.2.4 阴性样品溶液制备 按处方及其比例称取药材（缺制乌梅），按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法处理，即得制乌梅阴性样品溶液。
　　2.2.5 专属性试验 精密吸取上述供试品、枸橼酸对照品以及阴性样品溶液各5.0 μL注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定。枸橼酸保留时间为5.2 min，阴性杂质无干扰，提示本方法专属性良好。见图2。
　　2.2.6 标准曲线绘制 分别吸取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μL的0.4914 mg/mL的枸橼酸对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程：Y=67.34X+0.9540（r = 1.0000）。提示枸橼酸在0.098 28～24.57 μg范围内与峰面积线性关系良好。
　　2.2.7 精密度试验 取枸橼酸对照品溶液0.4914 mg/mL，注入高效液相色谱仪，连续进样6针，按“2.2.1”项下色谱条件测定。其峰面积的RSD为0.16%，提示仪器精密度良好。
　　2.2.8 稳定性试验 取芪贞降糖颗粒（批号：1606001）0.25 g，精密称定，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.2.1”项下色谱条件测定，其峰面积RSD值为0.3%。提示供试品溶液在室温条件下放置24 h基本稳定。
　　2.2.9 重复性试验 取芪贞降糖颗粒0.25 g（批号：1606001）精密称定，平行6份，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定。样品的平均含量为46.47 mg/g，RSD值为2.4%，提示该方法重复性良好。 　　2.2.10 加样回收率试验 取已知含量的芪贞降糖颗粒（批号：1606001，枸橼酸含量46.47 mg/g）9份，每份0.125 g，精密称定，精密加入枸橼酸对照品溶液（4.914 mg/mL）0.7、1.2、1.6 mL各3份，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定。平均加样回收率为100.18%，RSD%为2.3%。提示该方法准确性良好。见表1。
　　2.2.11 含量测定及其限度的制订 经过上述方法学试验验证，本法可用于芪貞降糖颗粒中枸橼酸的准确测定[15]。分别取芪贞降糖颗粒（批号：1606001、1606002、1606003）0.25 g，精密称定，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备，并按“2.2.1”项下色谱条件测定。3批中试样品选用的制乌梅饮片中枸橼酸含量较高（24.9%），与药典规定的饮片合格标准相差较大。在工艺稳定的情况下，势必导致芪贞降糖颗粒中的枸橼酸含量差异悬殊。因此，以2015版《中华人民共和国药典》对枸橼酸含量的基本要求（不得少于12.0%）作为制乌梅饮片的基本数值，以3批中试的平均转移率（56.6%）进行计算，每袋芪贞降糖颗粒应含有枸橼酸500 mg，以其80%作为含量下限，故暂定每袋芪贞降糖颗粒中含制乌梅以枸橼酸计算，不得低于400 mg/袋。见表2。
　　2.3 特女贞苷含量测定
　　2.3.1 色谱条件与系统适用性 Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-水（36∶64），柱温30℃，流速1.0 mL/min，检测波长为224 nm，进样体积为10.0 μL。
　　2.3.2 对照品溶液制备 精密称取特女贞苷对照品11.35 mg（按97.3%计，实际含量为11.04 mg），置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成浓度为1.104 mg/mL的溶液；分别精密吸取1 mL上述溶液，置于10 mL和25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为0.1104、0.044 16 mg/mL的特女贞苷对照品溶液[16-18]。
　　2.3.3 供试品溶液制备 取芪贞降糖颗粒（批号：16060 01）1 g，精密称定，加稀乙醇25 mL，超声提取5 min，冷却，稀乙醇补足减失重量，摇匀，12 000 r/min高速离心10 min，离心半径5.8 cm，取上清液。
　　2.3.4 阴性样品溶液制备 按处方及其比例称取余药材制备阴性样品（缺制女贞子），按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法制备，即得阴性样品溶液。
　　2.3.5 专属性试验 精密吸取上述供试品、特女贞苷对照品、阴性样品溶液各10 μL，按“2.3.1”项下色谱条件测定。特女贞苷保留时间为15.3 min，阴性杂质无干扰，提示本法专属性良好。见图3。
　　2.3.6 标准曲线绘制 分别精密吸取浓度为1.104 mg/mL特女贞苷对照品溶液2.5、5.0、10.0 μL，浓度为0.044 16 mg/mL特女贞苷对照品溶液0.5、1.0、2.5、5、10 μL，按“2.3.1”项下色谱条件测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程为：Y=1186X-0.5112（r = 1.0000），提示特女贞苷在0.022 08～11.04 μg与峰面积线性关系良好。
　　2.3.7 精密度试验 精密吸取浓度为0.044 16 mg/mL的特女贞苷对照品溶液10.0 μL，重复进样6次，计算峰面积的RSD值为1.0%，提示仪器精密度良好。
　　2.3.8 稳定性试验 取芪贞降糖颗粒（批号：1606001）1 g，精密称定，按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法制备，于0、1、2、4、6、8、12、24 h按“2.3.1”项下色谱条件测定。供试品中特女贞苷峰面积的RSD值为1.2%，提示供试品溶液中特女贞苷室温条件下放置24 h内稳定。
　　2.3.9 重复性试验 取芪贞降糖颗粒（批号：1606001）1 g，平行6份，按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.3.1”项下色谱条件测定。供试品中特女贞苷的平均含量为1.01 mg/g，RSD值为1.3%，提示本法重复性良好。
　　2.3.10 加样回收率试验 取含量已知的芪贞降糖颗粒（批号：1606001，特女贞苷含量1.01 mg/g）9份，每份0.5 g，精密称定，精密加入特女贞苷对照品溶液（1.104 mg/mL）0.3、0.5、0.7 mL各3份，按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法制备，注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定。特女贞苷的平均回收率为96.08%，RSD值为2.8%，提示本法准确性良好[19]。见表3。
　　2.3.11 含量测定及其限度制订 经上述方法学试验验证，本法可用于芪贞降糖颗粒中特女贞苷的准确测定。取芪贞降糖颗粒（批号：1606001、1606002、1606003）1 g，精密称定，按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法制备，并按“2.3.1”项下色谱条件测定。3批中试样品选用了特女贞苷含量为1.02%的制女贞子饮片，其含量高于2015版《中华人民共和国药典》制女贞子项下的含量要求。因此，以2015版《中华人民共和国药典》对特女贞苷含量的基本要求（不得少于0.7%）作为制女贞子饮片的基本数值，以3批中试的平均转移率（36.0%）进行计算，以其80%作为含量下限，故暂定每袋芪贞降糖颗粒中含制女贞子以特女贞苷计算，不得低于12 mg/袋。见表4。
　　3 讨论
　　除常规的颗粒剂的制剂通则检查项目外，本研究对原处方中除1味药材外的剩余3味药材分别开展定性定量研究，有效地控制了芪贞降糖颗粒质量，进而确保制剂的临床疗效和用药安全。 　　枸橼酸是芪贞降糖颗粒中君药制乌梅的指标性成分，制乌梅中枸橼酸含量高且在制剂工艺中转移率高，是芪贞降糖颗粒质量标准研究的首选指标性成分。本研究建立了芪贞降糖颗粒中制乌梅的指标性成分枸橼酸含量测定的HPLC法。本课题组在前期研究过程中[8-9]初步建立了芪贞降糖方提取液和浓缩液中枸橼酸的含量测定方法且专属性合格，在芪贞降糖颗粒质量标准研究过程中，进一步通过色谱柱筛选和优化分离条件，故本研究建立分离条件可以对颗粒中枸橼酸进行准确定量测定。
　　枸橼酸又称为柠檬酸，是植物界代表性的有机酸，广泛存在于各种中药中，《中华人民共和国药典》中乌梅、山楂等饮片均以此作为指标性成分，其含量较高、水溶性好且热稳定性佳，是制剂较为理想的检测指标。然而，正因为枸橼酸存在的广泛性，故一般复方质量标准研究时测定的专属性不易符合要求，且枸橼酸结构为无共轭结构的三羧酸，极性大且无紫外吸收，使用HPLC检测时的干扰较多，不易定量。本研究通过系统的方法学考察，建立了芪贞降糖颗粒中枸橼酸含量测定的HPLC方法，对其他类似复方制剂的质量控制具有较好的借鉴价值。
　　前期研究[9]证明处方制女贞子中特女贞苷具有热敏性，是制剂工艺可靠性监控的重要指示性成分，且在最终产品中含量水平也符合中药制剂定量指标的基本要求[20]，作为颗粒质量标准的定量检测指标是合理的。
　　本研究建立和优化了黄芪的薄层色谱鉴别方法，针对黄芪中多种皂苷在碱液处理过程中会相互转换的规律，在2015版《中华人民共和国药典》黄芪项下含量测定前处理的基础上，建立了碱化甲醇作为提取溶剂的前处理方法，此方法所得TLC斑点专属性强、清晰度高、分离度好、重现性佳且操作方法快速、简便。
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　　（收稿日期：2018-08-10 本文编辑：王 蕾）
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