山东栒子基因组DNA的提取和SRAP分子标记引物筛选

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　　摘要 根据山东栒子叶片多糖多酚多毛的理化性质，研究适合山东栒子便捷高效的基因组DNA提取方法。结果获得了纯度高、质量符合后续分子标记和遗传多样性分析要求的基因组DNA。采用6个不同种群的样品，利用150对SRAP引物组合进行筛选，确定了最佳反应体系为2×EsTaqMasterMix（含染料）12.5  μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物0.5  μL，dd H2O 10.5  μL，共筛选出11对多态性相对良好、条带较为清晰的引物组合。该研究为以后SRAP分子标记在栒子属植物遗传多样性方面的研究奠定了基础。
　　关键词 DNA提取;山东栒子;SRAP;引物筛选
　　中图分类号 S188+.1文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）10-0097-04
　　Abstract According to the physicochemical properties of polysaccharide polyphenols and hypertrichiasis from Cotoneaster schantungensis，a convenient and efficient genomic DNA extraction method suitable for C.schantungensis was studied.The obtained genomic DNA was of high purity and the quality was sufficient to satisfy the requirements of subsequent molecular marker experiments.For 6 plant samples from different populations，150 pairs of SRAP primer combinations were used to screen，and 2×EsTaqMasterMix （containing dye） 12.5  μL，40 ng/μL DNA template 1  μL，10 pmol/μL primer 0.5  μL，dd H2O 10 .5  μL of good system and 11 pairs of wellcharacterized bands with clear primer combinations were determined.This series of experiments laid the foundation for the experimental study of genetic diversity of SRAP molecular markers for the C.schantungensis and Cotoneaster genus species.
　　Key words DNA extraction;Cotoneaster schantungensis;SRAP;Primer screening
　　山東栒子（Cotoneaster schantungensis）隶属蔷薇科栒子属，是山东特有树种[1]，已列入山东珍稀濒危保护树种名录。过去仅生长于济南南部山区，种群数量少，屈素青[2]对16份野生种质进行遗传多样性分析，但样品数过少。近年来在泰山、徂徕山、鲁山等地发现了与山东栒子表型极为相似的栒子属种群，需要通过分子标记技术进一步鉴定其分类归属。分子标记技术因其方法相对简便、多态性高、成本低且满足多种遗传分析等优点，成为目前种质资源鉴定的高效技术手段之一[3-5]。迄今为止，遗传基因检测中常用的DNA分子标记技术主要包括RFLP、RAPD、AFLP、CDDP、SSR等，各种分子标记技术的复杂程度、稳定性及产生遗传信息的能力不同，各自具有优点和缺点。而SRAP作为功能序列扩增的分子标记技术[6]，因其操作简便、结果稳定、中等产率和相对较易得到选择条带序列的特点而被广泛应用于棉花[7]、西瓜[8]、黄瓜[9]、菊花[10]等植物的遗传多样性研究。
　　笔者利用SRAP分子标记对39份山东栒子样品以及50个表型相似的疑似山东栒子样品进行分析，在分子水平上验证新发现栒子种群的归属，更进一步深入分析山东栒子的遗传多样性，从而推动濒危植物山东栒子的保护与利用。由于栒子类植物叶片中含有多种次生代谢物质，如酚类、多糖等，且还有表面多毛、细胞壁较厚等特点，胞内物质很难被裂解出来，多蛋白多杂质，DNA易降解而RNA难去除等，经过反复试验证明，无法利用最常用的改良CTAB法提取DNA。因此，选择适合山东栒子的方法以去除这些因素对DNA质量的影响极其重要[11-12]。该试验旨在找出最便捷高效的山东栒子基因组DNA提取方法，筛选出高质量的SRAP引物，为验证新发现栒子属植物归属及山东栒子的遗传多样性研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　试验材料为采自山东泰山、徂徕山、佛峪、红叶谷、鲁山等地的89份样品，采集幼叶后，立即加入硅胶干燥，密闭储存于干燥黑暗环境以待备用。
　　1.2 试验仪器
　　研磨仪，低温高速离心机，电泳仪，水浴锅，紫外分光光度计，凝胶成像分析系统。
　　1.3 试剂
　　CTAB缓冲液（配方见表1），氯仿-异戊醇（V∶V=24∶1），无水乙醇，70%乙醇，1×TE，双蒸水（ddH2O），NaAc。
　　1.4 试验方法
　　1.4.1 准备工作。①准备高压蒸汽灭菌离心管、移液器枪头、提取介质、直径2 mL的小钢珠等;②将离心管（2.0、1.5 mL）标好对应标号; 　　③打开水浴锅预热，将CTAB缓冲液放于水浴锅中水浴预热备用。
　　1.4.2 山东栒子DNA的提取。
　　①称取样品0.2 g干燥叶片加入到2 mL离心管中，再加入3～5个 2 mm直径的小钢珠，盖紧离心管盖子。放入液氮桶中进行预冷。②将研磨机12孔圆盘用镊子夹住浸入液氮桶预冷，注意不要没过圆盘上端塑料片。
　　③将预冷后的离心管用镊子加入研磨盘中，以50 hz的频率研磨5 min，镊子取出磨样盘浸入液氮桶预冷30 s，继续以50 hz的频率研磨5 min。
　　④加入预先在65 ℃水浴锅中预热好的1 mL CTAB缓冲液，用振荡器摇匀后水浴15 min，每5 min左右轻轻上下摇匀。⑤取出离心管待冷却至室温后，放入离心机中，并以12 000 r/min的转速在常温下离心15  min。⑥准备新的2 mL离心管，写好编号。离心结束后，将离心管取出，抽取上清液共800  μL（少量多次抽取，每次取上清液200  μL，800  μL为上限）于新的2 mL离心管内，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），轻轻摇动离心管，直至管内液体上下不分层，即反应液混合均匀。
　　⑦将离心管再次放入离心机中，在低温模式4 ℃下以12 000 r/min的转速离心10 min，离心结束后观察离心管中间的白色蛋白层，如果中间蛋白质较多，需再次利用氯仿-异戊醇再次抽提剩余蛋白质杂质，直至中间白色蛋白层基本消失。
　　⑧准备一支新的1.5 mL离心管，编号。将400  μL上清液用有黄色平底枪头（每次100 μL）转移到1.5  mL离心管中。先加入1/10体积的3 mol/L NaAc试剂于上清液中，然后再加入2倍体积的-20 ℃无水乙醇，放入冰箱-20  ℃保存1 h以上待DNA凝结析出，再以12 000 r/min的转速在低温离心机4 ℃下离心3～5 min。
　　舍弃上清液，用约1 000  μL的70% 乙醇充分洗涤管底沉淀，轻弹管底使DNA与管底脱离以便充分洗涤，但注意不要将DNA弹散，轻轻摇动2～3次后，静置5 min，小心倒出乙醇后再重复此步骤2～3次，用移液器轻轻将剩余乙醇吸除后，将离心管开盖在避自然光室温下放置约3～4 h，或放置于37 ℃烘箱至烘干。
　　⑩将沉淀于50  μL的1×TE内溶解，并储存在4 ℃ 冰箱中（如若长期储存需放置在-20 ℃）。
　　1.4.3 山东栒子DNA质量检测。
　　针对山东栒子RNA难去除的特点，增加RNAase用量，延长水浴时间。将5  μL RNAase加入至提取的DNA样品中，轻轻摇匀，将混合好的DNA溶液置于37 ℃水浴锅中水浴1.5 h，目的在于完全去除DNA溶液中的RNA。
　　琼脂糖凝胶电泳检测：配制1%琼脂糖凝胶，利用gelred核酸燃料进行染色，凝结为固态胶后将胶置于电泳槽内，将5 μL除去 RNA的 DNA溶液和1  μL Loading Buffer的混合溶液依次点入琼脂糖凝胶孔中，然后在120V电压下电泳30 min，最后凝胶成像系統中观察、拍照。通过分光光度计检测DNA纯度和质量：当A260/280<1.8，表明其可能受到蛋白（芳香族）或酚类等物质的污染，需要进一步纯化样品，当A260/280>2.0，表明其原因可能是最终提取DNA产物中RNA未去除充分。
　　1.4.4 山东栒子SRAP分子标记引物筛选。
　　从佛峪、红叶谷、泰山、徂徕山、鲁山、抱犊崮6个地区的栒子基因组DNA中各挑选一个质量较高的DNA样品，利用引物对其进行扩增。SRAP引物参照Li等[4]的方法，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表2）。将上游和下游引物组合搭配共形成150对（山东栒子）引物组合，从中筛选出扩增条带较为清晰、丰富、稳定的引物组合，以用于后期试验的正式扩增。在经过多次反应体系试验调试后，确定了稳定性相对较为良好的PCR扩增体系：2×EsTaqMasterMix（含染料）12.5 μL，40 ng/μLDNA模板1 μL，10 pmol/μL引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。
　　采用25 μL PCR 反应体系，SRAP-PCR扩增在 Bio-Rad PCR仪（My Cycler）上完成。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5  min;94 ℃变性1 min，35 ℃退火1  min，72 ℃延伸1  min，进行5个循环;94 ℃变性1  min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1  min，进行30个循环;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
　　SRAP-PCR扩增结果检测：将6 μL扩增产物点于被gelred核酸染料染色的2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，在5V/cm的电压下进行电泳，1.5～2.0 h，电泳完成后，在凝胶成像分析仪上进行观察并采集图像。
　　2 结果与分析
　　2.1 山东栒子基因组DNA的提取
　　在改良DNA CTAB提取法的基础上，配制了新的综合CTAB提取缓冲液，在提取方法上也做了进一步的改良，且在一定程度上缩短了DNA提取时间，大大提高了提取效率。琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，DNA条带清晰，拖尾轻，无明显降解，完整性良好，表明新一代改良CTAB法能够更有效、更快速、更便捷地提取濒危植物山东栒子的DNA。
　　经检测，所提取的山东栒子基因组DNA的A260/280在1.66～1.84， DNA浓度在800～2 700 ng/μL，说明该试验所提取的DNA质量和产率均较高，足够满足SRAP-PCR对DNA的质量要求。这表明新一代改良CTAB提取DNA法能够有效地提取质量相对较高的栒子属基因组DNA。 　　2.2 山东栒子SRAP引物筛选
　　通过利用150对引物对选择出来的6份DNA材料进行扩增，并根据二元性状编码法统计扩增出的引物位点。舍弃未扩增出来条带，或扩增出条带相对较少且多态性条带较少，或者扩增出条带较多但多态性条带较少的引物，最终得出11对（表3）多态性相对较好、条带较为清晰的引物组合，用于后续的SRAP分子标记试验（图2）。其中扩增出多态性条带数最多的引物组合为EM4-EM11，多态性条带共有14条，最少的为ME8-EM9，多态性条带仅6条;引物组合ME4-EM11多态性最好，达93.33%，多态性最差的为ME6-EM12，仅为43.75%。
　　3 结论与讨论
　　植物基因组DNA的提取质量已成为分子标记试验是否成功的重要因素。由于植物的理化性质不同，因此需要选择适宜且更加高效便捷的DNA提取方法尤为重要[13]。由于山东栒子多糖多酚的特点，其细胞壁较厚难以裂解，DNA易
　　降解而RNA难去除的特点，难以获得适用于分子标记试验的高纯度、高质量的基因组DNA，经过反复试验不断研究探索后，在进一步改善了传统使用的改良CTAB提取DNA方法。选择利用研磨机以高频率充分研磨样品叶片，加速细胞的裂解，与普通加液氮利用研钵磨样相比，研磨机研磨2次并增加沁入液氮预冷次数，使整个研磨过程均能在低温环境下进行，降低操作和环境的影响，以保证研磨充分的同时也可以避免DNA降解;提取缓冲液中加入10%PEG 8000改变了细胞结构，增加细胞通透性以加快细胞膜的破裂;提高CTAB浓度以增加DNA提取效率;加入CTAB后，延长水浴时间，可以重分裂解细胞膜，使膜内物质完全释放;增加氯仿-异戊醇抽提的次数，可以相对减少蛋白质杂质对DNA纯度的影响;用乙醇洗涤沉淀前加入3 mol/μL的NaAc 溶液以去除多糖;增加RNAase用量，适当延长水浴时间以充分去除DNA中的RNA杂质。简化了试验操作过程，缩短试验时间，减少了试验过程中DNA降解的可能性也在一定程度上提高了试验效率。SRAP作为一种针对功能序列扩增的分子标记技术，具有简便、稳定、中等产率、易于获得选择条带序列的特点。每个采样种群中均选择一个基因组DNA质量较高的样品DNA，并利用150个引物进行筛选，最终确定：2×EsTaqMasterMix（含染料）12.5 μL，40 ng/μLDNA模板1 μL，10 pmol/μL引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL的反应体系，筛选出11对多态性较好的引物组合，其中多态性最好的为ME4～EM11，多态性高达93.33%，多态性最差的为ME6-EM12，多态性仅为43.75%。
　　该研究表明，新一代改良的CTAB提取方法在针对多糖多酚多杂质的植物基因组DNA的提取上具有良好可行性;SRAP分子标记引物筛选试验研究结果表明，SRAP分子标记在栒子属植物遗传多样性分析研究中效果较好，为山东栒子甚至栒子属的分子学研究奠定良好基础。
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