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黄瓜基因组DNA的提取方法筛选与优化研究

作者:未知

  摘要:本试验以黄瓜叶片为材料进行基因组DNA提取,优化提取高质量黄瓜基因组DNA技术。采用CTAB和SDS两种提取方法试验,琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示:CTAB法去多糖的效果好,提取的DNA纯度高。进一步优化CTAB提取液成分,发现 2% CTAB提取缓冲液加pvp和β- 巯基乙醇提取DNA的效果较好,纯度高。
  关键词:黄瓜;基因组;提取方法;优化研究
  中图分类号: S642.2                              文献标识码:  A                        DOI編号: 10.14025/j.cnki.jlny.2019.12.025
  不同植物的核酸结合蛋白情况各不相同,因此,植物基因组DNA的制备采取的提取方法不同,再有植物中多酚类合物以及多糖的污染会影响植物DNA的进一步利用,要从富含多酚和多糖植物组织中分离获得高质量的基因组DNA也并非易事。本文使用最常用的CTAB法和SDS法提取黄瓜基因组DNA,以优化提取方法,为黄瓜种质资源保护、鉴定以及分子育种等试验提供技术支持。
  1材料方法
  称取新鲜黄瓜叶片0.5g,流水冲洗干净、晾干,用液氮研磨成粉末后分别转入1.5ml离心管中,置于-20℃冰箱中保存备用。CTAB提取缓冲液、SDS提取缓冲液的配方,见表1。
  1.1 CTAB法和SDS法提取黄瓜基因组DNA
  CTAB法:于1.5ml离心管中加入600μl 预热65℃的2 % CTAB提取缓冲液,旋涡振荡混匀,将离心管置于65℃水浴保持30min,每10min轻轻摇晃离心管,使之充分混匀;冷却2min后,12000rpm离心10min,取上清放在新的离心管中,加入600μl氯仿,轻摇离心管使两者混合均匀;12000rpm离心10min,取上清转入含有乙醇的离心管中,将离心管上下摇动,有絮状DNA产生;12000rpm离心5min后,倒掉上清液,底部即DNA沉淀,加入无菌水使DNA溶解,置于-20℃冰箱保存备用。
  SDS法:加入600μl 2% SDS提取缓冲液,65℃水浴中保温30min,每10min轻轻摇晃离心管,使之充分混匀,取出后加入0.7倍5mol·L-1KAc,冰浴30min;12000rpm离心10min;取上清转入另一1.5ml离心管中,然后加入600μl氯仿:异戊醇(24∶1)摇匀,室温下12000rpm离心10min;取上清加入2/3倍体积的乙醇,颠倒离心管使混匀,静置10min,12000rpm离心10min;弃上清,室温下晾干加无菌水使沉淀完全溶解,放入 -20℃冰箱中保存备用。
  1.2 不同组分CTAB提取液,提取黄瓜基因组DNA比较
  将8个研磨好的样品分别加入1.2%CTAB提取缓冲液;2.2%CTAB提取缓冲液和2% pvp;3.2% CTAB提取缓冲液和1%β-巯基乙醇;4.2%CTAB提取缓冲液加1%β-巯基乙醇加2%pvp;5.4%CTAB提取缓冲液;6.4%CTAB提取缓冲液和2% pvp;7.4%CTAB提取缓冲液和1%β-巯基乙醇;8.4%CTAB提取缓冲液加2%pvp加1%β-巯基乙醇;DNA提取步骤同上。
  2 结果与分析
  2.1 CTAB法和SDS法提取黄瓜DNA的电泳检测结果
  图1(A)为CTAB法和SDS法的DNA提取结果比较,1和2为CTAB法提取黄瓜DNA,3和4为SDS法提取黄瓜DNA。由图可以看出SDS法提取的DNA电泳带没有CTAB法的亮,说明DNA含量高,并且对于多糖的去除效果明显。SDS提取的DNA量少,但DNA 纯度较高。蛋白污染需要进一步酚氯仿抽提。考虑到DNA产量问题,认为CTAB法提取要优于SDS方法。
  A:CTAB法和SDS法提取黄瓜基因组DNA
  B:不同组分CTAB提取液提取黄瓜基因组DNA
  2.2 不同组分CTAB提取液提取黄瓜DNA的电泳检测结果
  图1(B)显示2% CTAB提取缓冲液提取效果较好,4% CTAB提取缓冲液提取的DNA量很少,几乎没有电泳带,说明4%CTAB不适合用于黄瓜DNA的提取。处理1和2的叶片匀浆翠绿透明;处理3透明但颜色较处理1和处理2 稍暗;处理4较1和处理2暗,但比处理3颜色绿。匀浆颜色绿且透明是DNA 提取质量高的标志。虽然处理A 的叶片匀浆比处理4的更绿,但处理1 中模糊不均一的DNA 条带都有不同程度的拖尾,说明有程度不同的降解,处理2有胶状物聚集于点样孔形成亮带,说明有多糖和蛋白质污染。处理4的DNA条带清晰,且点样孔内没有亮带,说明没有蛋白质和多糖污染,提取黄瓜DNA的效果最好。
  黄瓜叶片上的叶脉越多越难研磨,而研磨时间越长,将导致DNA降解和褐化。2% CTAB法提取的黄瓜叶片的DNA带整齐明亮。NaCl、巯基乙醇和可溶性PVP能够有效地去除多糖和多酚类等杂质的干扰;若缺少此步骤,即使用酚、氯仿、异戊醇、NaCl和乙醇等物质多次抽提或沉淀也无法达到理想的纯化效果。使用CTAB法提取DNA时,水浴时间过短会造成DNA得率的下降,如超过1h,则可能会引起DNA的降解,因此,适宜的水浴时间当为40~60min。
  3 结论
  将CTAB和SDS两种提取方法对比,CTAB法提取出的DNA较纯,产量较高,并且在2%CTAB提取缓冲液中加1% β-巯基乙醇加2%pvp提取效果最好,可用于后续实验。
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