酶法辅助提取苦皮藤素工艺优化

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　　摘要：以苦皮藤素（Celastrus angulatus Maxim）根皮为原料，以苦皮藤素得率为指标，对碱性蛋白酶、纤维素酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶4种酶辅助提取苦皮藤素的效果进行比较分析，筛选出酶解效果较好的胃蛋白酶，再通过单因素试验和正交试验，优化胃蛋白酶辅助提取苦皮藤素的最佳工艺。结果表明，胃蛋白酶辅助提取苦皮藤素在酶解温度37 ℃、时间5 h、pH 2.0、加酶量66 000 U/g的条件下效果最好。
　　关键词：酶法;苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）;苦皮藤素;提取
　　中图分类号：Q55         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）06-0114-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.06.026           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Celangulin from the root skin of Celastrus angulatus were isolated using an enzye-assisted procedure. By analyzed the effects of alkaline protease， cellulase， pepsin and neutral protease on the extraction of celangulin， Pepsase was selected to optimize the extraction conditions. The results showed that the optimal conditions for celangulin extraction was found to be extraction with enzymatic hydrolysis with 66 000 U/g pepsase at 37 ℃ and pH 2 for 5 h. Under these conditions， the maximum yield of celangulin was obtained.
　　Key words： enzyme; Celastrus angulatus; celangulin; extraction
　　苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）系衛科南蛇藤属的一种多年生木质藤本植物，是中国著名的具有开发潜力的杀虫剂之一[1]。其含有的主要杀虫有效活性成分为苦皮藤素[2]，其防御病虫害机理已经取得了很大的进展[3，4]。传统提取苦皮藤素的方法与工艺，如索氏提取、热回流提取等已有研究[1，5]，而酶法辅助提取苦皮藤素鲜见报道。酶法辅助提取的原理是酶破坏细胞壁，整个过程反应条件温和，利用酶的专一性可避免对底物外物质的破坏[6]。该法可以提高产率、缩短时间、降低成本。
　　本试验采用酶法辅助溶剂提取苦皮藤素，利用碱性、中性与胃蛋白酶、纤维素酶进行辅助提取，优化提取工艺，下一步将对苦皮藤素作为天然植物杀虫剂的稳定性进行研究，为市场开发植物源杀虫剂苦皮藤素乳油提供依据。苦皮藤素能被开发利用，正是由于其对哺乳动物低毒，在环境中低残留，在现阶段其必将具有更广阔的研究与应用前景，更对秦巴山区植物种质资源的开发与利用有重要意义。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  试验材料  苦皮藤根皮粉末：苦皮藤采集于陕西省商洛市黑龙口镇，人工剥取苦皮藤根皮，阴凉条件下风干，粉碎机粉碎。
　　1.1.2  试剂与仪器  试剂：碱性蛋白酶（化学纯）、中性蛋白酶（化学纯）、胃蛋白酶（化学纯）、纤维素酶（化学纯），北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠（分析纯）。仪器： 全自动固液萃取仪（型号：B-811，步琦实验室设备贸易（上海）有限公司）、电子天平（型号：BSA223S，上海智泰电子科技有限公司）、恒温水浴锅（型号：HH-S，北京科伟永兴仪器有限公司）。
　　1.2  方法
　　1.2.1  苦皮藤素的提取  参考文献[2，6]的提取方法，称取10.00 g苦皮藤根皮粉末，置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL磷酸缓冲液煮沸5 min后过滤，以除去材料中的氧气。向滤渣中加入酶液，在最适温度水浴保温静置2 h，分别对苦皮藤根皮进行酶解，然后酶失活后过滤，在滤渣中加入甲醇进行提取，60 ℃提取6 h，浸提3次，过滤收集滤液，蒸发器处理滤液，称苦皮藤素质量。
　　1.2.2  酶的筛选  在提取所得的滤渣中加入100 mL磷酸缓冲液，按照表1加入酶液，用0.1 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L氢氧化钠调节pH，在最适温度水浴静置2 h，分别对苦皮藤根皮进行酶解、提取，选择得率最高的酶用于后续试验。
　　1.2.3  酶法辅助提取单因素试验  以苦皮藤素得率作为评价指标，分别对酶解pH（1、2、3、4、5）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）、酶解温度（27、37、47、57、67 ℃）和加酶量（22 000、44 000、66 000、88 000、120 000 U/g）进行单因素试验，以确定各因素的影响效果和最适范围。
　　1.2.4  酶法辅助提取正交试验  在单因素试验基础上，以酶解温度、酶解时间、酶解pH、加酶量作为考察因素，以苦皮藤素得率为考察指标，通过4因素3水平正交试验（表2），进一步优化提取工艺参数。 　　1.2.5  苦皮藤素得率计算  将干燥后的苦皮藤素称质量，计算得率，苦皮藤素得率（%）=苦皮藤素（g）/苦皮藤根皮样品的质量（g）×100。
　　2  结果与分析
　　2.1  酶种类的选择
　　在4种酶中，胃蛋白酶和碱性蛋白酶对苦皮藤素有较好的辅助提取效果，苦皮藤素得率分别为4.5%和4.2%，中性蛋白酶和纤维素酶辅助提取效果较差，得率分别为3.25%和3.16%（图1），因此，选定胃蛋白酶为苦皮藤素辅助提取所用酶。
　　
　　2.2  单因素试验结果
　　2.2.1  酶解pH对提取效果的影响  在酶解温度37 ℃、加酶量22 000 U/g、酶解2 h条件下，不同pH所得苦皮藤素得率结果见图2，pH 2对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。
　　
　　2.2.2  酶解温度对提取效果的影响  在酶解2 h、加酶量22 000 U/g、pH 2条件下，不同酶解温度所得苦皮藤素得率结果见图3，37 ℃对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。
　　2.2.3  酶解时间对提取效果的影响  在酶解温度37 ℃、加酶量22 000 U/g、pH 2条件下，不同酶解时间所得苦皮藤素得率结果见图4，酶解5 h对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。
　　
　　2.2.4  加酶量对提取效果的影响  在酶解温度为37 ℃、时间2 h、pH 2条件下，不同加酶量所得苦皮藤素得率结果见图5，加酶量44 000 U/g对辅助提取苦皮藤素有较好的效果。
　　
　　2.3  正交试验结果
　　以单因素试验结果为基础，采用正交试验优化胃蛋白酶辅助提取苦皮藤素工艺中的酶解时间、酶解温度、加酶量和pH 4种因素。从表3可知，各因素对酶法辅助提取的影响效果为B>A>C>D，即酶解温度对提取影响较为明显，其次是酶解时间、加酶量和pH，试验最佳组合为A3B2C3D2，即酶解5 h，酶解温度37 ℃，加酶量为66 000 U/g，酶解pH 2时，酶法辅助提取苦皮藤素得率为5.12%。
　　3  小结与讨论
　　在环境越来越受到人们关注的21世纪，对病虫害治理，人们一直在寻找对人畜无害或低毒的植物源杀虫剂，可以替代有害残留的化学药剂，许多植物次生代谢物质对农业害虫具有毒杀等生理学功能。较早就以苦皮藤为原料，提取分离出具有杀虫活性的苦皮藤素[7，8]，后续对其提取及工艺、杀虫机理等都展开了一系列研究，尤其以吴文君等[9，11]、张继文等[10]以浸提、层析等分离技术对苦皮藤素化合物展开的研究较为深入，后续也有以回流提取[12]、浸渍提取方法[2]的展开，但酶法辅助提取苦皮藤素的工艺鲜见报道。
　　酶法辅助提取过程中酶解pH、时间、温度及加酶量对苦皮藤素得率具有影响。通过单因素试验与正交试验表明，在酶解5 h，酶解温度37 ℃，加酶量为66 000 U/g，酶解pH 2时，酶法辅助提取苦皮藤素得率最大为5.12%。虽然酶法辅助提取没有复杂的操作过程，但酶的成本较高，与传统回流提取方法[12]并无明显差异，出现这种可能有多种因素，提取过程中苦皮藤素可能被酶解，酶解pH可能导致苦皮藤素溶解性降低等，因此，探索更加高效的苦皮藤素提取方式将是后续研究的重点。
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