从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究

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　　摘 要 目的：研究从发酵菌丝中提取甲壳素的工艺。方法：以曲霉菌丝体为原料，破壁处理，然后分别采用HCl溶液和NaOH溶液处理脱除矿物质和蛋白质，提取甲壳素。通过单因素试验优化了酸处理和碱处理条件，最终确定了甲壳素提取工艺：HCl浓度为1.0 mol/L，固液比1∶20，处理温度10 ℃，浸泡时间12 h；抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；NaOH浓度为2.0 mol/L，固液比1∶20，处理温度20 ℃，浸泡时间5 h，连续处理3次。结果：在此条件下得到的甲壳素灰分含量0.98%，残留蛋白质含量0.64%，菌体收率为41.15%。结论：该提取工艺制备得到的甲壳素产率高，灰分和杂蛋白含量少，且品质、色泽、残留灰分等方面优于虾蟹壳，提取工艺相对环保，适合于工业化生产。
　　关键词 赭曲霉 发酵 提取 甲壳素
　　中图分类号：TQ920.6； TQ929 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）11-0066-05
　　Study on the process of chitin extraction from Aspergillus mycelium*
　　YU Ying1**， LI Li2， RONG Shaofeng2， GUAN Shimin2***
　　（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）
　　ABSTRACT Objective： To study a process of chitin extraction from mycelia of Aspergillus ochraceus. Methods： Using Aspergillus mycelium as raw material， the conditions for acid and alkali treatment were optimized by single factor test and the extraction process was finally obtained. Results： Mycelia were soaked for 12 hours under the condition of solid-liquid ratio 1：20， 1 mol/L HCl at 10 ℃ for 12 h to remove mineral substances； socking with 2 mol/L NaOH at 20 ℃ for 5 h under the condition of solid-liquid ratio 1：20， repeat 3 times. The resultant chitin was with 0.89% of ash content， 0.74% of residual protein， the yield was 41.15%. Conclusion： The chitin prepared by the extraction process has high yield， low ash and impurity protein content， and its quality， color and residual ash are superior to that extracted from shrimp and crab shell， and the extraction process is relatively environmentally friendly， and is suitable for industrial production.
　　KEY WORDS Aspergillus； fermentation； extraction technology； chitin
　　甲殼素（chitin）又名几丁质、甲壳质，是一种广泛存在于自然界的天然高分子聚合物，主要存在于节肢动物如虾、蟹的外壳和真菌及一些藻类植物的细胞壁中[1]。目前商品化的甲壳素主要为虾、蟹壳提取制得，经过脱矿物质、脱蛋白和脱色处理[2]。微生物发酵法提取制备甲壳素是以菌丝体为原料采用酸碱交替法提取制得。与自虾、蟹中提取甲壳素相比，微生物发酵法有如下优势[3]：①简单发酵即可获得甲壳素，不受原料来源地域、时间的局限；②利用稀酸、稀碱即可提取，工艺相对环保；③菌丝体无机物含量较低，无需矿化等繁琐步骤；④无虾、蟹来源的蛋白等过敏原；⑤易工业化大规模生产。因此，真菌发酵生产甲壳素/壳聚糖极具应用前景，尽管有大量关于真菌发酵制备甲壳素的研究，但是其工业化应用鲜有报道[4-5]。此外，甲壳素脱乙酰产物壳聚糖和其酶解产物壳寡糖因生物活性更高，作为生物材料在医疗领域更具应用价值[6-9]。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　赭曲霉MF010（保藏号CGMCCNo.15668）由上海应用技术大学微生物实验室提供；甲壳素对照品（上海昊海生物科技股份有限公司，BR级）；NaOH [永华化学科技（江苏）有限公司，分析纯]；HCl（上海泰坦科技有限公司，分析纯）。
　　MSA-0420搅拌机（上海沉汇仪器有限公司）；DHP-9272电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HH-1电热恒温水浴锅（北京长源实验设备厂）；BS210S电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；DJ-04粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；SJL-1400马弗炉（上海倨晶精密仪器有限公司）；PH-3C pH计[雷磁（上海）有限公司]；HYG-3C恒温摇床（太仓市豪诚实验仪器制造有限公司）；SKD-800自动凯氏定氮仪（上海沛欧分析仪器有限公司）。 　　1.2 实验方法
　　1.2.1 发酵方法
　　斜面培养：将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下转接于斜面培养基中，于恒温恒湿培养箱中26 ℃培养5 d。
　　种子培养：将斜面菌种于无菌操作下，刮取孢子并转移至无菌生理盐水中悬浮，按照10%接种量转接于种子培养基中，在恒温摇床中（26 ℃，180 r/min）培养24 h。
　　发酵培养：将获得的种子培养液，于无菌操作下按照10%的接种量转接于发酵培养基中，在恒温摇床中（26℃，180 r/min）培养40 h。
　　1.2.2 甲壳素提取
　　菌体破壁处理：发酵液抽滤取滤渣，按照质量体积比，加入菌体湿重3倍的HCl溶液（质量分数为1.8%），搅拌破壁处理1 h，用NaOH溶液调节pH至6.0，抽滤取滤渣，用纯化水清洗滤渣至中性。滤渣用无水乙醇脱水2次后，置于烘箱中45 ℃烘干至恒重，获得干菌丝体。
　　酸处理：比较酸浓度、酸处理时间、酸处理温度和固液比对灰分去除和蛋白质含量的影响[10]。
　　碱处理：比较碱浓度、碱处理温度、碱处理时间、固液比对蛋白质去除和收率的影响[10]。
　　1.3 检测方法
　　灰分测定：参照中华人民共和国药典灰分测定法测定[11]。
　　蛋白质含量测定：参照中华人民共和国药典凯氏定氮法测定[11]附录88-89。
　　2 结果
　　2.1 酸处理
　　2.1.1 酸浓度对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响
　　HCl濃度在0.0～1.0 mol/L时，随着HCl浓度的增加灰分含量逐渐下降，脱除无机盐效果明显，灰分从初始的3.41%降低至1.45%，蛋白质含量由25.34%降低至16.32%，菌体收率为71.31%；HCl浓度超过1.0 mol/L后，其灰分含量下降趋势不明显，当HCl浓度增加到5.0 mol/L时，灰分含量为0.76%，蛋白质含量为15.87%，菌体收率为53.85%。在实际操作中，HCl浓度过高会使反应速率过快而不易控制，且随着HCl浓度的增加甲壳素易于水解，因此，HCl浓度为1.0 mol/L较合适（图1）。
　　2.1.2 酸处理时间对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响
　　反应时间在0～12 h，随着酸浸泡时间的增加，灰分含量急剧下降，由3.41%降低至0.96%，蛋白质含量由25.34%降低至15.99%，菌体收率由100%降低至64.81%，脱除无机盐效果明显。当反应时间超过12 h，其灰分含量、蛋白质含量以及菌体收率下降趋势减缓；17 h以后，HCl与钙盐的反应基本达到平衡，再延长时间对脱除无机盐效果的影响不大，但菌体收率却降低很多，因此，选择酸处理时间12 h更为合适（图1）。
　　2.1.3 酸处理温度对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响
　　随着反应温度的升高，无机盐脱除效果越好，灰分显著降低。当反应温度在-10～10 ℃时，随着温度的升高，脱除无机盐的效果较好，灰分由3.41%降低至0.98%，菌体收率由100%降低至67.51%，蛋白质含量由25.34%降低至16.35%。当反应温度高于10 ℃时，随着温度的升高，灰分含量及蛋白质含量下降缓慢，菌体收率由67.51%降低至32.27%，且菌丝体颜色变深且不易除去。考虑成本、菌体收率及脱除无机盐效果等因素，酸处理温度控制在10 ℃较为合适（图1）。
　　2.1.4 酸处理固液比对菌体中灰分去除及蛋白质含量的影响
　　随着固液比的增高，灰分含量、蛋白质含量及菌体收率均有不同程度的下降。当固液比达到1∶10，菌体总蛋白质含量下降至15.98%，继续增高固液比不能使蛋白质含量继续大幅降低。当固液比为1∶10，1∶20时，灰分含量分别为0.96%，0.67%，继续增高固液比，灰分含量下降不明显。随着固液比增高，菌体收率下降幅度明显，当固液比为1∶10，1∶20时，菌体收率分别为67%，65%，当固液比继续增高，收率下降幅度加大，当固液比为1∶50时，菌体收率仅为38%（图1）。总体来看，在保证菌体收率尽可能高的前提下，固液比为1∶20，蛋白质及灰分去除效果最好。因此，最佳固液比为1∶20。
　　2.2 碱处理
　　2.2.1 碱浓度对蛋白质去除和收率的影响
　　随着NaOH浓度的提高，蛋白质去除的效果越好。当NaOH浓度为2 mol/L时，蛋白质含量为3.48%，菌体收率为49.54%，灰分含量为1.03%，当NaOH浓度为5 mol/L时，蛋白质含量为2.97%，菌体收率为45.39%，灰分含量为1.39%，对蛋白质去除的影响效果不大，且随着NaOH浓度的增加，易使几丁质脱乙酰化生成壳聚糖，因此，选择浓度为2 mol/L的NaOH溶液碱处理（图2）。
　　2.2.2 碱处理时间对蛋白质去除和收率的影响
　　在反应的初始阶段，随着碱处理时间的延长，蛋白质含量急剧下降，蛋白去除效果明显，反应5 h后，蛋白含量从19.95%降低为3.75%，灰分含量由0.56%增加为0.84%，而菌体收率由63.92%降低为50.58%；碱处理时间在5～14 h，蛋白质含量下降趋势减缓，由3.49%降低为0.68%，而灰分含量由0.84%增加为1.20%，菌体收率损失较大，由50.58%降低为35.28%。一般来说，蛋白质去除时间越长水解越彻底，考虑到长时间反应会带来生产成本上的增加，因此，选择碱处理时间5 h为宜（图2）。
　　2.2.3 碱处理固液比对蛋白质去除和收率的影响
　　从理论来说，固液比越大，蛋白质去除的效果越好。当固液比从1∶0增加到1∶20时，蛋白质含量由19.95%降低为3.58%，灰分含量从0.56%升高为0.85%，菌体收率从63.92%降低为43.97%。当固液比1∶20增加到1∶50时，蛋白质含量由3.58%降低为1.32%，灰分升高了0.42%，菌体收率由43.97%降低为30.02%，即当固液比大于1∶20时，对蛋白质的去除影响不大，且菌体收率损失较大，废水排放量增多，所以选择固液比1∶20为宜（图2）。 　　2.2.4 碱处理温度对蛋白质去除和收率的影响
　　随着碱处理温度的升高，蛋白质含量略有下降，当温度为20 ℃时，蛋白含量降低为1.56%，灰分含量增加为1.06%，菌体收率降低为47.71%；当温度继续升高时，蛋白质去除效果不明显，温度从20 ℃增加到80 ℃时，蛋白含量由1.56%降低为1.08%，灰分含量由1.06%增加为1.36%，而菌体收率却由47.71%降低为32.10%，菌体收率损失较大。温度对NaOH水解蛋白质影响较大，在其它条件固定的情况下，反应温度越高，蛋白质碱水解的速度越快；但温度达到20 ℃时，蛋白质的碱水解反应趋于平衡，继续升温对蛋白质去除的效果不明显。因此，选择碱处理温度20 ℃为宜（图2）。
　　2.2.5 碱处理次数对蛋白质去除和菌体收率的影响
　　随着碱处理次数的增加，蛋白质、灰分及菌体收率均有所下降。碱处理2次，灰分含量为0.92%、蛋白含量为0.94%、收率为42.73%。碱处理3次，灰分含量为0.98%、蛋白含量为0.64%、收率为41.15%。3次碱处理虽然会降低最终收率，但蛋白质含量可以降低至1.0%以下，所以，选择3次碱处理为宜（图2）。
　　2.3 最佳工艺的试验结果
　　确定甲壳素提取的最佳工艺条件：HCI浓度为1.0 mol/L，固液比1∶20，處理温度10 ℃，浸泡时间12 h；然后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；NaOH浓度为2.0 mol/L，固液比1∶20，处理温度20 ℃，浸泡时间5 h，连续处理3次。处理后的菌体粉末于45℃烘箱烘干2 h，得到的白色粉末即为甲壳素。在以上工艺条件下展开3次平行实验的结果如表1。
　　3 讨论
　　本实验采用单因素试验从发酵菌丝体中提取甲壳素的工艺进行了研究，分析提取工艺的不同反应条件对甲壳素中残留灰分、蛋白含量以及产率的影响，最终确定了甲壳素提取的最佳工艺条件。在以上工艺条件下制备的甲壳素为白色粉状固体，产量能达到5 g/L，且品质、色泽、残留灰分等方面均优于虾蟹壳[12-13]，灰分含量为0.98%，残留蛋白质含量为0.64%，菌体收率为41.15%，提取工艺相对环保。后续的研发工作将主要围绕无动物源发酵培养基优化及中试放大，建立适于工业放大的曲霉MF010发酵生产甲壳素的发酵工艺和提取工艺。
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　　关键词 西他沙星 D-3 核磁共振二维谱解析
　　中图分类号：O657.61； R978.19 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）11-0071-04
　　Separation of sitafloxacin-related substance D-3 and its analysis of molecular structure by using 2D-NMR
　　CHEN Bin*， LI Zhenye， LIU Xia， ZHANG Guiju， YU Xiang， XIE Yongju**（Jiangxi Fushine Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jiangxi Jingdezhen 333000， China）
　　ABSTRACT Sitafloxacin is the fourth-generation quinolone antibacterial agent and its substance D-3 is one of the degradation impurities. The D-3 produced in the synthesis was isolated by preparative thin-layer chromatography and its structure was elucidated using 1H-NMR， 13C-NMR， 1H-1HCOSY， DEPT135， HSQC and HMBC.
　　KEY WORDS sitafloxacin； D-3； 2D-NMR elucidation
　　西他沙星（sitafloxacin）是第四代喹諾酮类抗菌药物，2008年在日本首先上市。西他沙星抗菌谱广，特别是对呼吸道病原菌的抗菌活性较强，临床上用于治疗严重的难治性细菌感染、复发性感染以及某些耐药菌感染。西他沙星的有关物质D-3（图1）是西他沙星酸降解杂质中的一种，现还未见有其分离方法及其核磁共振谱图信号归属的研究，仅见有用1H-NMR测定西他沙星含量的报告[1]。本文利用制备性薄层色谱法分离在西他沙星合成过程中产生的D-3，并用核磁共振一维谱和二维相关谱1H-1HCOSY、DEPT135、HSQC、HMBC对分离的D-3进行结构归属解析。
　　1 仪器与试剂
　　1.1 仪器
　　Bruker 400 MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；UTP-313电子天平（上海花潮电器有限公司）。
　　1.2 试剂
　　中间体Ⅰ（按文献[2]合成）；氢化钠（60%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二氧六环、浓盐酸、冰醋酸、氯仿（均国药集团化学试剂有限公司）；氘代二甲基亚砜（DMSO-d6，氘含量>99.8%、HDO<0.2%，加标1%，上海麦克林生化科技有限公司）；制备性硅胶板（20 cm×20 cm，烟台江友硅胶开发有限公司）。
　　2 实验方法
　　D-3的核磁共振波谱均用Bruker 400 MHz核磁共振波谱仪检测，波谱仪配有5 mm四核反向检测探头，检测以DMSO-d6为溶剂、四甲基硅烷为内标。1H-NMR检测的观测频率为400 MHz，13C-NMR检测的观测频率为100 MHz。DEPT135检测的工作频率及谱宽与13C-NMR相同。核磁共振实验采用5 mm直径的核磁管，一维、二维实验均于控温下进行。
　　3 D-3的分离
　　在100 ml四口烧瓶中依次加入中间体Ⅰ3.65 g、二氧六环36 ml，搅拌溶解，降温至15 ～ 20 ℃后，再分批缓慢加入60% NaH 0.4 g，搅拌反应0.5 h，加入冰醋酸5 ml，继续搅拌反应2 h。反应液于50 ～ 55 ℃下减压蒸馏至干，固体以50 ml二氯甲烷溶解，然后滴加至25 ml水中，搅拌，静置分层，分出有机相，减压浓缩至固体析出，得中间体Ⅱ（图2）。
　　在250 ml反应瓶中依次加入上述中间体Ⅱ、浓盐酸17 ml、冰醋酸17 ml，搅拌，升温至90 ～ 100 ℃反应12 h，再加入浓硫酸20 ml，升温至105 ～ 120 ℃继续反应15 d。降至室温，反应液以200 ml乙酸乙酯分6次萃取，萃取液减压浓缩至剩少量液体，然后进行制备性薄层色谱法分离[硅胶板规格20 cm×20 cm，展开剂乙酸乙酯∶甲醇=6∶1（体积比）]。当展开剂前沿到达硅胶板一定高度时取出硅胶板，热风机吹干后重新放入展开缸，继续展开（共3次，展开剂前沿到达的高度分别为硅胶板高度的55%、75%和95%处）。展开完成后，于254、365 nm的紫外灯下找到并分出D-3点（Rf=0.15）。分出的D-3点用20 ml乙腈浸泡5 ～ 6 h，过滤，滤液减压蒸馏至干，得D-3 0.35 g（用HPLC检测，纯度为97.5%）。
　　4 D-3的核磁共振波谱解析
　　以DMSO-d6为溶剂，进行D-3的核磁共振波谱检测。
　　1H-NMR谱图（图3）显示，D-3分子中有多组质子信号，共含7个质子，部分活泼质子未出峰。δ 2.50是溶剂的质子信号。
　　13C-NMR谱图（图4）显示，D-3分子中有多组碳信号，共含13个碳。
　　DEPT135谱图（图5）显示，D-3分子中有1组仲碳、4组叔碳或伯碳，其余为季碳。依据HSQC谱图（图6）可以确认各组碳与氢的连接关系。
　　DEPT135谱图显示，δ 17.15（J=10 Hz）为仲碳，对应为C16。对应的HSQC谱图中，δ 1.62 ～ 1.82（m， 2H）归属为H16。根据脂肪族碳的出峰规律，δ 42.07和δ 73.86（J=222 Hz）为高场碳，对应为环丙烷部分，结合氟对相连接的碳原子的裂分规律，因此δ 73.86（J=222 Hz）归属为C15，δ 42.07归属为C14。对应的HSQC谱图中，δ 4.34（s， 1H）归属为H14，δ 5.13（d， J=64 Hz， 1H）归属为H15。
　　在DEPT135谱图中，δ 153.89和δ 110.21（J=20 Hz）为叔碳，再依据HMBC谱图（图7），C14与δ 8.79（s， 1H）有相关，因此δ 8.79（s， 1H）归属为H5，δ 7.99（d， J=1.2 Hz， 1H）归属为H10。对应的HSQC谱图中，δ 153.89归属为C5，δ 110.21（J=20 Hz）归属为C10。
　　在HMBC譜图中，δ 176.71与H10有相关，根据羰基碳的出峰规律，δ 176.71归属为C3，δ 165.50归属为C19。
　　在HMBC谱图中，δ 137.85与H5、H10均有相关，根据苯环间位相关信号增强的规律，δ 137.85归属为C1。δ 149.79（J=20 Hz）与H10有相关，因此δ149.79（J=20 Hz）归属为C8。根据氟对相连接的碳原子的裂分规律并结合芳香族碳的出峰规律，δ 150.57（J=246 Hz）归属为C9。δ 107.68与H5有相关，因此δ107.68归属为C4。根据氟对苯环其他碳原子的裂分规律以及δ 119.67与H5有弱相关，而δ 111.68与H5无弱相关，因此δ 119.67归属为C2，δ 111.68归属为C7。
　　依据1H-NMR谱图并结合羧酸活泼氢的出峰规律，δ 14.59（br， 1H）归属为H21。
　　1H-1HCOSY谱图（图8）显示，δ 1.62 ～ 1.82（m， 2H）的质子与δ 4.34（s， 1H）、δ 5.13（d， J=64 Hz， 1H）的质子有耦合关系，即H14、H15、H16为相邻关系，验证了上述1H-NMR谱图的解析结果。
　　至此，D-3的1H-NMR和13C-NMR谱图解析完毕，结构归属结果归纳见表1和表2。
　　5 结语
　　本研究通过制备性薄层色谱法分离西他沙星有关杂质D-3，并用1H-NMR、13C-NMR以及核磁共振二维相关谱DEPT135、HSQC、HMBC、1H-1HCOSY对分离的 D-3进行结构归属解析，实现了西他沙星有关物质D-3 1H-NMR和13C-NMR谱图数据的全归属解析。
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