铁棒锤种子蛋白质提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳研究
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摘要：目的 构建适合铁棒锤种子蛋白质研究的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）体系，为铁棒锤种子纯度检测及鉴别研究提供技术支撑。方法 采用6种蛋白质提取法提取伏毛铁棒锤种子蛋白质，并筛选出最佳提取方法，在此基础上研究不同分离胶浓度、料液比、上样量对伏毛铁棒锤种子蛋白电泳分离效果的影响，并采用筛选出的蛋白质最佳提取分离方法对铁棒锤和伏毛铁棒锤种子进行鉴定。结果 巯基乙醇法提取的伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳图谱效果较佳，电泳谱带数最多（14条）、最清晰，适合于其种子纯度检测;分离胶浓度为15%、料液比为1∶10（M/V）、蛋白上样量稀释5倍时，其种子蛋白质电泳分离效果较好;铁棒锤和伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳图谱在蛋白质谱带位置和强弱上有一定差异。结论 本研究建立的铁棒锤种子蛋白样品制备方法及SDS-PAGE技术可用于铁棒锤种子纯度检测，其蛋白质图谱可作为铁棒锤与伏毛铁棒锤种子的鉴别依据。
关键词：铁棒锤;种子;聚丙烯酰胺凝胶电泳;蛋白质提取;鉴定
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）06-0064-06
Abstract： Objective To establish the appropriate SDS-PAGE system for study on protein from Aconitum pendulum Busch. seeds; To provide technical support for the purity detection and identification of Aconitum pendulum Busch. seeds. Methods Six protein extraction methods for Aconitum pendulum Busch. seeds were tested， and the best extraction method was selected out. Based on the optimal extraction method， the effects of different separation gel concentrations， solid-liquid ratios and sample loadings on the electrophoretic separation of protein from Aconitum pendulum Busch. seeds were studied. The optimal protein extraction and separation method was used to identify seeds of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz. Results The electrophoresis pattern of Aconitum flavum Hand. Mazz. extracted by thiol ethanol method was better， and the electrophoresis band number was the most （14） and the clearest， which were suitable for its seed purity detection. When the concentration of separation gel was 15%， the ratio of material to liquid was 1：10 （M/V）， and the amount of protein sample was diluted by 5 times， the separation effect of seed protein was better. The electrophoresis patterns of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz. had some differences in the position and strength of the protein bands. Conclusion The developed methods of seed protein extracting and SDS-PAGE electrophoresis technique can be used for seed purity detection， and the protein fingerprints can be applied to identify seeds of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz.
Keywords： Aconitum pendulum Busch.; seed; SDS-PAGE; extraction of protein; identification
鐵棒锤为毛茛科植物铁棒锤Aconitum pendulum Busch.和伏毛铁棒锤Aconitum flavum Hand. Mazz.的干燥块根和幼苗，收载于《中华本草·藏药卷》[1]，具祛瘀活络、止血镇痛等功效，临床常用于跌打损伤、风湿性关节痛、骨折等的治疗，疗效显著[2-3]。
近年来，随着市场需求的增加，铁棒锤野生资源急剧下降，开始由野生转为人工栽培，其繁殖方式主要是种子繁殖[4]，故种子的检验是保证种子质量的重要措施，也是保证药材品种和质量的重要前提[5]。种子所含蛋白的种类和数量携带了其长期演化的遗传特征，具有很高的稳定性、专属性。而种子蛋白电泳技术具有不需将种子萌发、送检样品可及时分析等优点，已广泛应用于植物和农作物的纯度测定、品种鉴定和亲缘关系分析[6]，在中药材种子鉴别、品种纯度测定方面也开始应用[7-9]。目前有关铁棒锤种子的研究主要集中在化学成分及品质方面[10-11]，其种子蛋白研究尚未见报道，因而利用电泳图谱鉴定铁棒锤种子纯度的方法值得探究。本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术研究铁棒锤种子蛋白质提取的最适宜方法和电泳条件，建立适用于其种子鉴别的SDS-PAGE技术体系，为铁棒锤种质资源的保护、评价、种子鉴定、纯度测定提供依据。 1 仪器与试药
DYY-10C型电泳仪（北京市六一仪器厂），DYCZ-23A型垂直电泳槽电泳槽（北京市六一仪器厂），TGL16M型高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司），BX7200HP型超声波清洗器（上海新苗医疗器械制造有限公司）。
铁棒锤种子于2017年10月收集于甘南州合作市铁棒锤种植基地，伏毛铁棒锤种子于2017年10月收集于甘肃省临夏回族自治州和政药用植物园，经杜弢教授鉴定，分别为铁棒锤Aconitum pendulum Busch.和伏毛铁棒锤Aconitum flavum Hand. Mazz.的种子。三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、甲叉双丙烯酰胺（Arcy/Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、巯基乙醇、溴酚蓝、甘油、冰醋酸、丙烯酰胺、考马斯亮蓝G250，天津市大茂化学试剂厂;过硫酸铵（APS），烟台市双双化工有限公司。
2 方法与结果
2.1 溶液配制
2.1.1 浓缩胶缓冲液
精密称取6 g Tris，加入约60 mL蒸馏水，用1 mol/L盐酸调pH值至6.8，蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，摇匀，4 ℃冰箱保存备用。
2.1.2 分離胶缓冲液
精密称取18.15 g Tris，加入约60 mL蒸馏水，用1 mol/L盐酸调pH值至8.8，蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，摇匀，4 ℃冰箱保存备用。
2.1.3 样品缓冲液
精密吸取浓缩胶缓冲液1.0 mL、50%甘油0.8 mL、10%SDS 1.6 mL、TEMED 0.4 mL、0.05%溴酚蓝0.2 mL、蒸馏水4.0 mL于试管中，摇匀，备用。
2.1.4 电极缓冲液
精密称取Tris 3.03 g、甘氨酸14.4 g、SDS 1.0 g，溶入900 mL蒸馏水，定容至1000 mL容量瓶中，摇匀，4 ℃冰箱保存备用。
2.1.5 10%、12%、15%分离胶溶液
按表1顺序加入试剂，立即混匀，备用。
2.5 蛋白质含量测定
2.5.1 考马斯亮蓝溶液制备
精密称取100 mg考马斯亮蓝G250，溶于90%乙醇50 mL中，加入85%（W/V）磷酸100 mL，再用蒸馏水定容到1 L容量瓶中，摇匀，过夜后过滤，滤液贮藏于棕色瓶中，室温保存。
2.5.2 牛血清蛋白标准溶液制备
精密称取牛血清蛋白25 mg，加蒸馏水溶解后定容至100 mL容量瓶中，再从中吸取40 mL，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，摇匀，置4 ℃冰箱存放，备用。
2.5.3 供试品溶液制备
精密称取伏毛铁棒锤种子粉末0.2 g，按“2.2”项下方法提取蛋白质，将提取出的蛋白质溶液定容至10 mL容量瓶中，摇匀，作为贮备液。精密吸取0.2 mL贮备液至具塞试管中，加入0.8 mL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，备用。
2.5.4 含量测定方法
按表2配制浓度为0、20、40、60、80、100 ?g/mL系列对照品溶液，摇匀，放置2 min，在595 nm波长处比色测定，以吸光度（Y）对牛血清蛋白含量（X）进行回归处理，得回归方程：Y=0.011 6X+0.016 9（r2=0.999 1）。
2.6 料液比对伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳的影响
采用巯基乙醇法提取伏毛铁棒锤种子蛋白质，料液比分别设为1∶10、2∶10、3∶10、1∶15、1∶20、1∶25，电泳结果见图2。
2.7 上样量对伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳的影响
采用巯基乙醇法提取伏毛铁棒锤种子蛋白质，吸取蛋白质提取液40 ?L，用样品缓冲液稀释3～12倍，电泳结果见图3。
2.8 铁棒锤种质鉴定
采用巯基乙醇法、15%分离胶、1∶10料液比、蛋白质提取液稀释5倍上样量进行铁棒锤和伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳图谱比较，结果见图4。
由图4可以看出，铁棒锤和伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳谱带在着色度和位置上存在差异：伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳谱带较铁棒锤清晰，泳道背景较深;伏毛铁棒锤种子蛋白质在电泳第二段中间多了一条带，铁棒锤种子蛋白质电泳在电泳第二段与第三段中间多了一条带（图中箭头所示）。因此，可根据这2条特征谱带鉴别铁棒锤和伏毛铁棒锤种子。
3 讨论
本试验对溶液配制时间及贮存温度要求较高，如SDS需要在室温条件下保存，其他配制溶液需在4 ℃冰箱保存，10%APS则需现配现用，所有试剂配制后贮存时间超过1个月则严重影响电泳图谱效果，故需严格控制所配溶液使用时间。
蛋白质电泳图谱清晰程度和谱带分离效果与分离胶和浓缩胶有一定关系，如分离胶凝固不完全则谱带分离不清晰，浓缩胶凝固不完全则梳子很难取出，点样困难，进而影响谱带分离，故在制胶过程中需保留足够时间凝胶，再进行后续试验。
6种提取方法所得伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳结果显示，巯基乙醇法和丙酮沉淀法提取的伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳图谱效果好，SDS-PAGE电泳谱带数最多、最清晰，其谱带数为14条，但丙酮沉淀法由于沉淀种子蛋白质的量较大，在上样时需要稀释次数多，步骤较巯基乙醇法繁琐，故最适宜的蛋白质提取方法为巯基乙醇法。
电泳相关因素对伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳效果影响的研究结果表明，不同料液比、上样量及分离胶浓度对种子蛋白质电泳图谱的影响很大。在种子量保持不变情况下，提取液太少或太多都会影响谱带的分离及清晰度;提取液稀释倍数太少或太多也会影响谱带的分离及清晰度;高浓度分离胶较低浓度分离胶更有利于种子蛋白质的分离。 铁棒锤和伏毛铁棒锤种子蛋白质电泳图谱结果表明，二者種子蛋白质电泳谱带在位置和着色度方面存在差异，可根据存在的特征谱带鉴别铁棒锤和伏毛铁棒锤种子。
综上所述，本试验建立的SDS-PAGE电泳方法经济、适用、可行，可用于铁棒锤种子纯度检测及种质鉴定。本研究结果对铁棒锤种质资源的保护、评价、种子鉴定、纯度测定及育种具有重要意义。
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（收稿日期：2018-07-27）
（修回日期：2018-08-13;编辑：陈静）
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