不同粒度的青稞粉中提取β一葡聚糖的工艺研究
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摘要：青稞属禾本科大麦属作物，由于它的籽实没有外壳，所以又称为裸大麦、米大麦、淮麦及元麦，主要分布在我国青海、西藏、四川的甘孜州、云南的迪庆、甘肃的甘南等地。青稞为海拔4200-4500m高寒地区唯一的农作物，具有高蛋白、高纤维、高维生素、低脂肪、低糖等特点，并富含微量元素、β -葡聚糖等营养成分。其中B-葡聚糖化学名称为（1-3）（1-4） -β -D-葡聚糖，是一类非淀粉多糖，分为水溶性和水不溶性两类。近年的研究发现，青稞中B-葡聚糖具有清肠、调节血糖、降低胆固醇、提高免疫力的功能，是对人体健康十分有益的一种可溶性膳食纤维。为合理利用青稞农作物，最大程度提取青稞中的β-葡聚糖，本文通过实验，采用万能粉碎机对青稞米进行粉碎，筛选不同目数的青稞粉，提取后通过比较β-葡聚糖的得率和提取量，从而确定最佳粒度。
关键词：青稞;β -葡聚糖;粒度;提取;分光光度法
为合理利用青稞农作物，最大程度提取青稞中的β一葡聚糖，对青稞米粉碎的粒度进行考察，确定最佳粉碎粒度，本文采取了以下实验方法：采用万能粉碎机对青稞米进行粉碎，筛选不同目数的青稞粉，提取后通过比较β一葡聚糖的得率和提取量，从而确定最佳粒度。结果表明：粉碎粒度为80目时，青稞β-葡聚糖的提取效果最好。最终得出结论：青稞米最佳粉碎粒度为80目时，能最大程度提取出青稞中的β-葡聚糖。
一、实验仪器、材料
AB135-S型电子天平（梅特勒一托利多公司）;FS-30B型万能粉碎机（康华制药机械有限公司）;药典筛（浙江上虞市五四纱筛厂）;DZKW-D-I型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）;pH计（梅特勒一托利多仪器上海有限公司）;旋转蒸发仪（EYELA东京理化器械株式会社）;DZKW-S -8型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）;WH-90A型微型漩涡混合器（上海振荣科学仪器有限公司）;TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用有限公司）;15mL离心管、12mL比色管、移液枪（200μL和5mL）;青稞米（青海）;β-葡聚糖标准品（SIGMA公司，纯度>95%）;混联β-葡聚糖检测试剂盒（Megazyme公司产品，货号K-BGLU）;超纯水：公司超纯水系统生产;二水磷酸二氢钠、氢氧化钠、冰醋酸、乙醇、柠檬酸均为分析纯。
二、青稞原料中
β一葡聚糖含量检测方法学研究
试剂盒使用相关说明。Megazyme的β-葡聚糖测定试剂
盒可进行100次的测定试验，该试剂盒包含完整的测定方法及以下试剂，
瓶1：苔藓酶悬浮液（1mL，4℃条件下可保存3年以上），使用時用20mL的20mmol/L pH6.5磷酸缓冲溶液稀释瓶1中全部物质，可用聚丙烯管分装合适大小的几份后于-20℃条件下贮存，在取出使用期间需保持苔藓酶低温，在-20℃条件下可稳定保存两年以上。
瓶2：β一葡聚糖苷酶悬浮液（1mL，4℃条件下可保存3年以上），使用时用20mL的50mmol/L pH4.0的乙酸钠缓冲溶液稀释瓶2中全部物质，用聚丙烯管分装合适大小的几份后于-20℃条件下贮存，取出使用期间需保持苔藓酶低温，在-20℃条件下可稳定保存两年以上。注意：不要让苔藓酶和β -葡聚糖苷酶交叉污染。
瓶3：GOPOD试剂缓冲溶液（48mL，pH7.4，对羟基苯甲酸和0.4 %W/V叠氮化钠，4℃条件下可保存4年以上），使用时用IL蒸馏水稀释瓶3中全部的物质，立即使用。
瓶4：GOPOD试剂酶（葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4一氨基安替比林，为冻干粉，-20℃条件下可保存5年以上），使用时瓶3稀释后的1L溶液分次溶解瓶4中所有的物质，转移至试剂瓶，即为葡萄糖决定试剂GOPOD.用铝箔避光保存。在2-5℃条件下可稳定保存3个月，在-20℃条件下可稳定保存一年以上。
瓶5：D-葡萄糖标准溶液（5mL，1.Omg/mL，含0.2%的苯甲酸），在室温条件下可稳定保存五年以上。
瓶6：标准大麦样品，β一葡聚糖含量见小瓶上的标签，在室温条件下可稳定保存五年以上。
瓶7：标准燕麦样品，β一葡聚糖含量见小瓶上的标签，在室温条件下可稳定保存五年以上。
缓冲溶液的配制。磷酸缓冲溶液（ 20mmol/L，pH6.5）：溶解3.12g的二水磷酸二氢钠（NaH2P04‘2H20）到900mL的蒸馏水中，用lOOmmol/L的NaOH （4g/L）调节pH至6.5（加入约50mL能够达到要求），再加入蒸馏水配成IL的缓冲溶液。加入0.2g的叠氮化钠在4℃条件下可稳定保存2个月。
醋酸钠缓冲溶液（ 50mmol/L，pH4.0）：加入2.9mL的冰醋酸到900mL的蒸馏水中，用Imol/L的NaOH调节其pH到4.O，再用蒸馏水配成IL的缓冲溶液。加入0.2g的叠氮化钠在4℃条件下可稳定保存2个月。
醋酸钠缓冲溶液（200mmol/L，pH4.O）：加入11.6mL的冰醋酸到900mL的蒸馏水中，用Imol/L的NaOH调节其pH至4.0，再加入蒸馏水配成IL的缓冲溶液。加入0.2g的叠氮化钠在4℃条件下可稳定保存2个月。注意：调节pH之前一定不能加叠氮化钠！酸性条件下叠氮化钠会放出毒气。
检测步骤。1.准确称取适量样品加入到15mL离心管中，确保全部样品都落到离心管底部。2.加入0.2mL的乙醇溶液（ 50%，v/v）于离心管底部，旋涡混合器混匀，以辅助样品分散;再加入磷酸钠缓冲溶液（4.OmL，20mmol/L，pH6.5），用旋涡混合器把溶液混合均匀。3.混匀后，立即将离心管置于沸水浴中保温60秒;取出用旋涡混合器混合均匀后再放到100℃沸水浴中保温2分钟，并且再次混匀。4.在50℃的水浴中保温平衡5分钟。5.加入苔藓酶（0.2mL，IOU）并且振摇，密封离心管并且在50℃的水浴中保温1小时，保温期间在旋涡混合器上剧烈振荡3-4次。6.加入醋酸钠缓冲溶液（5.OmL，200mmol/L，pH4.0）并用旋涡混合器充分混合。7.待离心管冷却至室温（约需5分钟），离心分离（3000r/min，10分钟），小心准确地移取上清液0.1mL到三支试管的底部（12mL）。8.加入用50mmol/L醋酸钠缓冲溶液（pH4.O）配制的β -葡聚糖苷酶（O.lmL，0.2U）到其中的两个试管中（反应管），第三个试管中直接加入醋酸钠缓冲溶液（空白管），将所有的试管在50℃条件下保温10分钟。9.加入GOPOD试剂（3.OmL）到每一个试管，在50℃条件下进一步保温20分钟。10.在5lOnm处测定试管中的溶液吸光度值，在一个小时以内完成测定。11.每次实验必须设定空白对照和50μg/0.1ml或lOOμg/0. Iml葡萄糖标准，设定重复管。空白对照包括：0. ImL蒸馏水+O. ImL醋酸钠缓冲溶液+3.OmL GOPOD试剂。葡萄糖标准包括：0.1mL醋酸钠缓冲溶液+O.lmL D-葡萄糖标准（lOOμg/O.lmL）+3.OmLGOPOD试剂。12.每次测定必须包括一个标准大麦样品。 精密度试验。称取适量青稞原料粉末（过三号药典筛）以1.2.3方法处理并显色后，5lOnm重复测量6次，读取吸光度，计算RSD值为0.02%，相关数据见表1。
稳定性试验。用精密度试验样品在显色完成后分别过0、10、20、30、40、50、60分钟于5lOnm测定吸光度，计算吸光度的RSD值为0.17%，相关数据见表2。
重复性试验。称取青稞原料粉末（过三号药典筛）约80mg于15mL离心管底部，精密称定6份，按照1.2.3检测步骤处理样品并显色后于紫外可见分光光度计上5lOnm测定吸光度，计算得到该青稞原料β -葡聚糖平均含量为5.5553%，重复性试验的RSD值为1.26%，相关数据见表3。
加标回收试验。精密称取1.2.6重复性试验中取样量一半的青稞原料粉末，分别加入各自β一葡聚糖含量80%、100%、120%三个梯度的β一葡聚糖对照品各3份，按照1.2.3检测方法处理显色后于5lOnm读取吸光度，根据检测数据计算该方法检测青稞原料中β一葡聚糖含量的平均回收率97.28%，加标回收试验的RSD值为2.17%，相关数据见表4。
试验结论。精密度试验中青稞原料的RSD值为0.02%，表明检测结果的随机误差较小。稳定性试验青稞原料的RSD值为0.17%，表明该检测方法显色后在1小时内稳定性良好。该青稞原料中β-葡聚糖平均含量为5.5 553%，重复性试验的RSD值为1 .26%，表明检测结果重复性良好。青稞原料中β-葡聚糖对照品的回收率为94.37%-100.43%，平均值为97.28%，RSD值为2. 17%，表明該检测方法检测青稞原料及青稞提取物中β一葡聚糖含量准确可靠。
三、实验方法
青稞米的粉碎。将青稞米用万能粉碎机进行粉碎，通过不同目数编号（1—9号）的药典筛进行过筛处理，收集不同目数的青稞粉，备用。
青稞粉的提取。药材量：20g。提取条件：15倍量水，用浓盐酸调节ph至5，水浴锅加热至60℃下进行提取1次，2小时/次。过滤：用滤纸趁热过滤，收集滤液。浓缩干燥：65℃下减压浓缩青稞提取液，制备青稞提取物，称其重量，计算得率。检测：按照1.2中Megazyme公司混联β-葡聚糖检测试剂盒方法检测青稞提取物中β -葡聚糖的含量。
实验结果。不同编号对应的药典筛筛网目数得到的青稞粉，提取后得到的青稞提取物质量以及β-葡聚糖的含量结果如下表5。从表中可以看出粒度为80目时，青稞β-葡聚糖的提取量最大，β -葡聚糖的含量也最高。
实验讨论。不同粉碎粒度的青稞粉进行提取时，粉末越细，可提取出来的β -葡聚糖越多，但也并不是越细越好。因为粉末越细，提取时容易成糊糊状，提取并不能完全。以青稞β-葡聚糖最大提取量和最高含量为结果进行比较，确定青稞米的最佳粉碎粒度为80目。
四、结论
从实验结果来看，青稞米的最佳粉碎粒度为80目时，青稞β -葡聚糖的提取效果最好，提取量最大，其含量也最高。
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