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Box-Benhnken响应曲面法优化五味子中木脂素的微波提取工艺

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  摘要:目的:利用响应曲面法优化五味子果实中木脂素微波提取工艺。方法:在单因素试验基础上,根据Box-Benhnken中心组合设计原理,以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取功率为自变量,木脂素含量为响应值,设计4因素3水平响应面分析试验来确定最佳提取工艺。结果:响应面优化的最佳提取工艺为乙醇浓度84%,料液比为1∶15,提取次数为2次,提取功率为800W。结论:响应面分析所得二次模型方程能较好地预测实验结果,实验设计和响应曲面法优化得到的提取工艺参数准确可靠,该研究可为从北五味子中提取木脂素成分提供一个较为有效的方法。
  关键词:五味子;木脂素;响应曲面法
  基金项目:吉林农业科技学院大学生科技创新科研项目(2017063);吉林农业科技学院博士启动基金项目(2017411)
  中图分类号: TQ460.6                                  文献标识码:  A                          DOI编号:   10.14025/j.cnki.jlny.2019.06.014
  五味子(Schisandra chinensis)是木兰科五味子属植物。五味子中有效成分木脂素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝降酶等功效[1]。一直以來,对五味子木脂素提取工艺的研究一直在推陈出新,但多以正交试验方法进行试验处理,其筛选得到的结果差异性大、重复性差[2]。传统的提取方法常采用超声提取法,该工艺的不足在于提取时间长、消耗能源大,而微波提取法是将微波辐射与溶剂萃取相结合,具有提取时间短、溶剂用量少、提取成本低等优点[3-4]。本研究将微波提取法用于五味子果实中木脂素的提取,以五味子中含量高的4种木脂素含量为考察指标,在单因素试验基础上,采用Box-Behnken试验设计筛选五味子果实中木脂素的最佳提取工艺,提供一个从五味子中提取木脂素的较为有效的方法。
  1 材料与仪器
  1.1 仪器
  XH-100A微波超声波合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司)、1260型高效液相色谱仪(安捷伦)、R1001-VN型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)、SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、SE602F型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)、HP-010型真空泵(天津市恒奥科技发展有限公司)、FB-01T过滤器。标准品五味子醇甲(ZJ0109BA13)、五味子醇乙(PM0303SA14)、五味子甲素(P26M6R1)、五味子乙素(PA0414RA14)购买于上海源叶生物科技有限公司,纯度均大于98%。所用试剂均为分析纯。
  1.2 材料
  五味子2017年6月采自于吉林农业科技学院药用植物资源圃。经吉林农业科技学院老师李赫男鉴定为五味子科(Schisandraceae)五味子属(Schisandra)五味子(Schisandra chinensis (Turcz.)Baill.)的果实。
  2 方法与结果
  2.1 五味子果实的处理
  将五味子果实粉碎,置于55℃烘箱中烘至恒重,过40目筛后备用。
  2.2 五味子果实中木脂素含量测定
  2.2.1 溶液的制备
  2.2.1.1 对照品溶液 精确称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品各5mg于10mL的容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得质量浓度均为0.5mg/mL的标准品溶液,置4℃冰箱中保存[5]。
  2.2.1.2 供试品溶液制备 精密量取单因素考察和响应面曲线法制得的五味子果实溶液10,进入HPLC检测其四种木脂素含量。
  2.2.2 色谱条件 色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×150mm,5μm);流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱0~30min 45%A~75%A;30~45min 75%A~100%A;45~55min 100%A;流速1mL/min;柱温30℃;进样量10μL;在254nm波长处进行检测[6-7],色谱图见图1。
  A:对照品溶液;B:样品溶液;1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子甲素;4.五味子乙素。
  2.2.3 标准曲线的绘制  取配制的对照品溶液,分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL,按色谱条件进行色谱分析,记录色谱峰面积,以色谱峰面积(y)为纵坐标,质量浓度(x)为横坐标,绘制标准曲线,求出各木脂素线性回归方程,见表1。
  2.2.4方法学考察
  2.2.4.1 精密度试验  分别精密吸取4种对照品溶液,重复进样5次,进样量10,按色谱条件进行 HPLC分析,记录峰面积。结果显示,五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD值分别为0.46%、0.88%、0.68%、0.59%(n=5),表明仪器精密度良好。
  2.2.4.2 重复性试验  取同一批样品3份,按“2.2.1.2”方法制备成供试品溶液,按色谱条件进行HPLC分析,记录峰面积,测得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD值分别为0.72%、0.79%、1.13%、0.97%,表明本方法的重复性良好。
  2.2.4.3 稳定性试验  取同一供试品溶液分别放置0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h后按上述色谱条件下进样测定,记录峰面积,计算木脂素含量。结果显示:供试品溶液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD值分别为0.89%、0.78%、1.12%、0.98%(n=5),结果表明,供试品溶液在24h内稳定性良好。   2.2.4.4 加样回收率试验  精密称取5份已知上述4种木脂素含量的五味子粉末1.000g,各精密加入适量的对照品溶液,按“2.2.1.2”方法制备样品溶液,根据上述色谱条件进行检测分析,测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量。由测得量和加入量,计算各成分的加样回收率,结果符合定量测定要求,表明本法准确可靠,详见表2。
  3 响应面法优化五味子果实中木脂素的微波提取工艺
  在微波提取法单因素试验的基础上,选取乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、提取次数(X3)、提取功率(X4)四個因素,通过Design-Expert8.0.6软件进行Box-Benhnken的响应面设计和数据分析,具体试验因素与各水平值见表3。
  根据Box-Benhnken的组合设计原理,采用Design-Expert
  8.0.6软件设计四因素三水平共29个试验,其中心点重复5次试验,以木脂素含量为响应值,具体试验设计方案与结果见表4。
  利用Design-Expert8.0.6软件对表4中的数据进行多元拟合,得到五味子醇甲对乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、提取次数(X3)、提取功率(X4)的二元多项模型方程分别为:
  Y醇甲=-19.18341+0.15717*X1+0.68745×X2+1.73405*
  X3+0.017979*X4+2.01500×10-3*X1X2-0.0269*X1X3+1.73225×104*X1X4+0.019755*X2X3-9.69150×10-4*X2X4+7.49500×10-4*
  X3X4-1.52812×10-3*X12-4.14543×10-3*X22-0.11441*X32-9.11233×10-6*X42;对该模型进行方差分析,结果见表5。从表中可看出模型的F值和P值(F醇甲=3.94、P醇甲=0.0075;F醇乙=10.52、P醇乙<0.0001;F甲素=9.13、P醇甲<0.0001;F乙素=7.59、P醇甲=0.0003),表明模型对提取工艺影响极显著。R醇甲2=0.8977、R醇乙2=0.9132、R甲素2=0.9012、R乙素2=0.8835,变异系数(C·V%)分别为10%、20.14%、23.95%、31.21%,Radj醇甲2=0.8954、Radj醇乙2=0.8264、Radj甲素2=0.8025、Radj乙素2=0.8671,表明模拟程度良好,试验误差较小。根据回归方程中的各项系数及表5回归方程的方差结果可知,在所选因素范围内各个因素对五味子木脂素提取含量的影响顺序,五味子醇甲和五味子醇乙:提取浓度>料液比>提取次数>提取功率;五味子甲素和五味子乙素:提取浓度>提取次数>料液比>提取功率。
  响应面曲面可较直观的反映各因素及两两因素的交互作用对响应值(木脂素含量)的影响。五味子微波提取的响应面3D图(略),乙醇浓度对微波提取木脂素含量影响最大,提取功率影响最小。
  运用Design-Expert8.0.6软件优化得到的微波提取木脂素最佳提取工艺为乙醇浓度83.97%,料液比为1∶15,提取次数为2次,提取功率为763.24W,在此条件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量分别为3.8017、0.9158mg/g、0.9792mg/g、2.5823mg/g。考虑到微波功率参数为整数,将提取条件调整为乙醇浓度84%,料液比为1∶15,提取次数为2次,提取功率为800W。
  4 结论
  本研究以五味子中4种含量高的木脂素为测定目标,利用响应曲面法优化微波提取技术提取五味子中木脂素成分,通过四因素、三水平的Box-Benhnken 设计优化得到最佳微波提取工艺,提供一个从五味子中提取木脂素较为有效的方法。
  经响应曲面法优化后的五味子木脂素微波提取工艺,是以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取功率四个因素为最低值和五味子醇乙含量为最高值来进行预测,实现了以五味子为原料提取木脂素成分节省试剂、耗能低、耗时短、效率高等特点,为微波提取五味子中木脂素成分提供一个较为有效的方法。
  参考文献
  [1]周进东,陆兔林,毛春芹,等.HPLC测定五味子不同炮制品中6种木脂素类成分的含量[J].中国药学杂志,2011,46(17):1353-1356.
  [2]金银萍,王博,刘兴医,等.Box-Behnken响应曲面法优化五味子木脂素的提取工艺[J].江苏农业科学,2017,48(22):210-212.
  [3]黄天辉,蒋艳萍,周俊,等.正交试验设计优选微波提取五味子中五味子醇甲的研究[J].中草药,2007,38(12):1824-1825.
  [4]焦士龙.微波提取中药有效成分实验研究[D].天津大学,2007.
  [5]刘俊霞,逢世峰,窦凤鸣,等.五味子果实和藤茎提取液脱色剂的筛选[J].中国药房,2015(25):3541-3544.
  [6]姚莹,上官盈盈,王玮.HPLC测定北五味子果实、藤茎超临界萃取物中木脂素的含量[J].中国药学杂志,2010,45(21):1661-1663.
  [7]韩宁宁,郑芳.高效液相色谱法测定益气固本糖浆中五味子醇甲的含量[J].湖北中医药大学学报,2013,15(03):36-38.
  作者简介:赵大伟,在读本科生,研究方向:制药工程。
  通迅作者:刘俊霞,博士研究生,讲师,研究方向:中药新药开发与利用。
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