Box-Benhnken响应曲面法优化五味子中木脂素的微波提取工艺

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　　摘要：目的：利用响应曲面法优化五味子果实中木脂素微波提取工艺。方法：在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取功率为自变量，木脂素含量为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验来确定最佳提取工艺。结果：响应面优化的最佳提取工艺为乙醇浓度84%，料液比为1∶15，提取次数为2次，提取功率为800W。结论：响应面分析所得二次模型方程能较好地预测实验结果，实验设计和响应曲面法优化得到的提取工艺参数准确可靠，该研究可为从北五味子中提取木脂素成分提供一个较为有效的方法。
　　关键词：五味子;木脂素;响应曲面法
　　基金项目：吉林农业科技学院大学生科技创新科研项目（2017063）;吉林农业科技学院博士启动基金项目（2017411）
　　中图分类号： TQ460.6                                  文献标识码：  A                          DOI编号：   10.14025/j.cnki.jlny.2019.06.014
　　五味子（Schisandra chinensis）是木兰科五味子属植物。五味子中有效成分木脂素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝降酶等功效[1]。一直以來，对五味子木脂素提取工艺的研究一直在推陈出新，但多以正交试验方法进行试验处理，其筛选得到的结果差异性大、重复性差[2]。传统的提取方法常采用超声提取法，该工艺的不足在于提取时间长、消耗能源大，而微波提取法是将微波辐射与溶剂萃取相结合，具有提取时间短、溶剂用量少、提取成本低等优点[3-4]。本研究将微波提取法用于五味子果实中木脂素的提取，以五味子中含量高的4种木脂素含量为考察指标，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计筛选五味子果实中木脂素的最佳提取工艺，提供一个从五味子中提取木脂素的较为有效的方法。
　　1 材料与仪器
　　1.1 仪器
　　XH-100A微波超声波合成仪（北京祥鹄科技发展有限公司）、1260型高效液相色谱仪（安捷伦）、R1001-VN型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）、SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、SE602F型电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、HP-010型真空泵（天津市恒奥科技发展有限公司）、FB-01T过滤器。标准品五味子醇甲（ZJ0109BA13）、五味子醇乙（PM0303SA14）、五味子甲素（P26M6R1）、五味子乙素（PA0414RA14）购买于上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%。所用试剂均为分析纯。
　　1.2 材料
　　五味子2017年6月采自于吉林农业科技学院药用植物资源圃。经吉林农业科技学院老师李赫男鉴定为五味子科（Schisandraceae）五味子属（Schisandra）五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）的果实。
　　2 方法与结果
　　2.1 五味子果实的处理
　　将五味子果实粉碎，置于55℃烘箱中烘至恒重，过40目筛后备用。
　　2.2 五味子果实中木脂素含量测定
　　2.2.1 溶液的制备
　　2.2.1.1 对照品溶液 精确称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素对照品各5mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度均为0.5mg/mL的标准品溶液，置4℃冰箱中保存[5]。
　　2.2.1.2 供试品溶液制备 精密量取单因素考察和响应面曲线法制得的五味子果实溶液10，进入HPLC检测其四种木脂素含量。
　　2.2.2 色谱条件 色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6×150mm，5μm）;流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱0～30min 45%A～75%A;30～45min 75%A～100%A;45～55min 100%A;流速1mL/min;柱温30℃;进样量10μL;在254nm波长处进行检测[6-7]，色谱图见图1。
　　A：对照品溶液;B：样品溶液;1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子甲素;4.五味子乙素。
　　2.2.3 标准曲线的绘制  取配制的对照品溶液，分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，按色谱条件进行色谱分析，记录色谱峰面积，以色谱峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，求出各木脂素线性回归方程，见表1。
　　2.2.4方法学考察
　　2.2.4.1 精密度试验  分别精密吸取4种对照品溶液，重复进样5次，进样量10，按色谱条件进行 HPLC分析，记录峰面积。结果显示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD值分别为0.46%、0.88%、0.68%、0.59%（n=5），表明仪器精密度良好。
　　2.2.4.2 重复性试验  取同一批样品3份，按“2.2.1.2”方法制备成供试品溶液，按色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积，测得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD值分别为0.72%、0.79%、1.13%、0.97%，表明本方法的重复性良好。
　　2.2.4.3 稳定性试验  取同一供试品溶液分别放置0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h后按上述色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算木脂素含量。结果显示：供试品溶液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD值分别为0.89%、0.78%、1.12%、0.98%（n=5），结果表明，供试品溶液在24h内稳定性良好。 　　2.2.4.4 加样回收率试验  精密称取5份已知上述4种木脂素含量的五味子粉末1.000g，各精密加入适量的对照品溶液，按“2.2.1.2”方法制备样品溶液，根据上述色谱条件进行检测分析，测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量。由测得量和加入量，计算各成分的加样回收率，结果符合定量测定要求，表明本法准确可靠，详见表2。
　　3 响应面法优化五味子果实中木脂素的微波提取工艺
　　在微波提取法单因素试验的基础上，选取乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、提取次数（X3）、提取功率（X4）四個因素，通过Design-Expert8.0.6软件进行Box-Benhnken的响应面设计和数据分析，具体试验因素与各水平值见表3。
　　根据Box-Benhnken的组合设计原理，采用Design-Expert
　　8.0.6软件设计四因素三水平共29个试验，其中心点重复5次试验，以木脂素含量为响应值，具体试验设计方案与结果见表4。
　　利用Design-Expert8.0.6软件对表4中的数据进行多元拟合，得到五味子醇甲对乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、提取次数（X3）、提取功率（X4）的二元多项模型方程分别为：
　　Y醇甲=-19.18341+0.15717*X1+0.68745×X2+1.73405*
　　X3+0.017979*X4+2.01500×10-3*X1X2-0.0269*X1X3+1.73225×104*X1X4+0.019755*X2X3-9.69150×10-4*X2X4+7.49500×10-4*
　　X3X4-1.52812×10-3*X12-4.14543×10-3*X22-0.11441*X32-9.11233×10-6*X42;对该模型进行方差分析，结果见表5。从表中可看出模型的F值和P值（F醇甲=3.94、P醇甲=0.0075;F醇乙=10.52、P醇乙<0.0001;F甲素=9.13、P醇甲<0.0001;F乙素=7.59、P醇甲=0.0003），表明模型对提取工艺影响极显著。R醇甲2=0.8977、R醇乙2=0.9132、R甲素2=0.9012、R乙素2=0.8835，变异系数（C·V%）分别为10%、20.14%、23.95%、31.21%，Radj醇甲2=0.8954、Radj醇乙2=0.8264、Radj甲素2=0.8025、Radj乙素2=0.8671，表明模拟程度良好，试验误差较小。根据回归方程中的各项系数及表5回归方程的方差结果可知，在所选因素范围内各个因素对五味子木脂素提取含量的影响顺序，五味子醇甲和五味子醇乙：提取浓度>料液比>提取次数>提取功率;五味子甲素和五味子乙素：提取浓度>提取次数>料液比>提取功率。
　　响应面曲面可较直观的反映各因素及两两因素的交互作用对响应值（木脂素含量）的影响。五味子微波提取的响应面3D图（略），乙醇浓度对微波提取木脂素含量影响最大，提取功率影响最小。
　　运用Design-Expert8.0.6软件优化得到的微波提取木脂素最佳提取工艺为乙醇浓度83.97%，料液比为1∶15，提取次数为2次，提取功率为763.24W，在此条件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量分别为3.8017、0.9158mg/g、0.9792mg/g、2.5823mg/g。考虑到微波功率参数为整数，将提取条件调整为乙醇浓度84%，料液比为1∶15，提取次数为2次，提取功率为800W。
　　4 结论
　　本研究以五味子中4种含量高的木脂素为测定目标，利用响应曲面法优化微波提取技术提取五味子中木脂素成分，通过四因素、三水平的Box-Benhnken 设计优化得到最佳微波提取工艺，提供一个从五味子中提取木脂素较为有效的方法。
　　经响应曲面法优化后的五味子木脂素微波提取工艺，是以乙醇浓度、料液比、提取次数、提取功率四个因素为最低值和五味子醇乙含量为最高值来进行预测，实现了以五味子为原料提取木脂素成分节省试剂、耗能低、耗时短、效率高等特点，为微波提取五味子中木脂素成分提供一个较为有效的方法。
　　参考文献
　　[1]周进东，陆兔林，毛春芹，等.HPLC测定五味子不同炮制品中6种木脂素类成分的含量[J].中国药学杂志，2011，46（17）：1353-1356.
　　[2]金银萍，王博，刘兴医，等.Box-Behnken响应曲面法优化五味子木脂素的提取工艺[J].江苏农业科学，2017，48（22）：210-212.
　　[3]黄天辉，蒋艳萍，周俊，等.正交试验设计优选微波提取五味子中五味子醇甲的研究[J].中草药，2007，38（12）：1824-1825.
　　[4]焦士龙.微波提取中药有效成分实验研究[D].天津大学，2007.
　　[5]刘俊霞，逢世峰，窦凤鸣，等.五味子果实和藤茎提取液脱色剂的筛选[J].中国药房，2015（25）：3541-3544.
　　[6]姚莹，上官盈盈，王玮.HPLC测定北五味子果实、藤茎超临界萃取物中木脂素的含量[J].中国药学杂志，2010，45（21）：1661-1663.
　　[7]韩宁宁，郑芳.高效液相色谱法测定益气固本糖浆中五味子醇甲的含量[J].湖北中医药大学学报，2013，15（03）：36-38.
　　作者简介：赵大伟，在读本科生，研究方向：制药工程。
　　通迅作者：刘俊霞，博士研究生，讲师，研究方向：中药新药开发与利用。
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