Box-Behnken响应面法优化健脾祛湿丸水提工艺

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　　 摘要：目的  采用Box-Behnken响应面法，优化健脾祛湿丸的水提工艺。方法  以丹酚酸B、多糖含量及浸膏得率的综合评分为指标，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面法考察浸泡时间、加水倍量和提取时间对水提工艺的影响。结果  最佳提取工艺为：浸泡1 h，加11倍量水，回流提取3次，每次1.20 h。结论  优选的工艺方便、稳定、可行，可为后续研究提供依据。
　　关键词：健脾祛湿丸;水提工艺;丹酚酸B;多糖;Box-Behnken响应面法
　　中图分类号：R283.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）05-0092-06
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.020 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Objective To optimize the water extraction process of Jianpi Qushi Concentrated Pills by using box-behnken response surface method. Methods Salvianolic acid B， total polysaccharide content and extract yield were set as the evaluation indexes. On the basis of single factor experiment results， the Box-Behnken response surface method was used to investigate the effects of soak time， adding water amount times and extracting time on the water extraction process. Results The optimum extraction technology was soaking for 1 h， with 11 times the amount of water extracted for three times， each time 1.20 h. Conclusion The optimum process is convenient， stable and feasible， which can provide references for follow-up study.
　　Keywords： Jianpi Qushi Concentrated Pills; water extraction process; salvianolic acid B; total polysaccharide; Box-Behnken response surface method
　　健脾祛濕丸处方来源于新疆医科大学附属中医医院皮肤科刘红霞教授经验方，临床用于脾虚湿盛所致的白疕（寻常型银屑病），其病机为内湿、外燥，燥湿共存、燥湿互化，这也是银屑病不断恶化、难以治愈的原因之一[1]。健脾祛湿丸由丹参、白花蛇舌草、甘草、茯苓等11味药组成。方中丹参味苦，性微寒，归心、肝经，具有活血通经、养血安神、凉血消痈、清心除烦功效[2]。丹酚酸B为丹参中含量最高的水溶性活性成分，近年研究发现其在扩血管、抗血栓形成，改善微循环调节组织的修复与抑菌方面作用显著，因此在皮肤病治疗中的应用日益广泛[3-5]。中药多糖具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，且几乎没有毒性，健脾祛湿丸处方中多味药物含有多糖成分。
　　多糖作为中药的主要活性成分之一，参与和介导了细胞各种生命现象的调节，特别在调节免疫功能方面尤为重要[6-7]。因原方以医院制剂——散剂的形式在临床应用多年，为提高药物稳定性，减少刺激性，遮盖中药散剂不良口感，方便患者服用，拟将此方开发为浓缩丸。
　　Box-Behnken响应面法是一种多因素非线性试验条件优选方法，可评估因素的非线性影响，在处方优化中广泛使用[8]。本试验依据健脾祛湿丸处方的功能、主治及组方药物的理化性质，运用Box-Behnken响应面法优化健脾祛湿丸的水提工艺，为本课题的后续研究奠定基础。
　　1  仪器与试药
　　Waters 2424高效液相色谱仪，美国Waters;SI-234电子天平（d=0.1 mg），丹佛仪器（北京）有限公司;Direct-QTM5型超纯水仪，美国Millipore公司;DLSB-10/20低温冷却液循环泵，郑州长城科工贸有限公司;Dl-820智能超声波清洗器，上海之信仪器有限公司;KDM型调温电热套，山东甄城光明仪器有限公司。
　　丹酚酸B对照品（批号111562-201313，纯度97.0%），中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher），磷酸等其他试剂均为分析纯，水为超纯水。丹参、绵萆薢、薏苡仁、白花蛇舌草、茯苓等饮片均购于亳州市中正中药材饮片有限公司，经检验均符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）各药项下有关规定。
　　2  方法与结果
　　2.1  丹酚酸B含量测定
　　2.1.1  色谱条件
　　色谱柱：XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流动相：0.1%磷酸-乙腈（79∶21）;进样量：10 ?L;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：286 nm[2]。色谱图见图1。
　　2.1.2  对照品溶液的制备 　　精密称取适量丹酚酸B对照品，加甲醇-水（8∶2）混合溶液制成浓度为0.60 mg/mL的丹酚酸B对照品贮备液。
　　2.1.3  供试品溶液的制备
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，加10倍量水，加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，取上清液30 mL，蒸干，加甲醇-水（8∶2）混合溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，过滤，取续滤液，即得。
　　2.1.4  阴性对照溶液的制备
　　按处方量称取除丹参外拟水提的药物饮片，按“2.1.3”项下方法制备，即得。
　　2.1.5  线性关系考察
　　精密吸取“2.1.2”项下对照品贮备液，加甲醇分别稀释至0.048、0.096、0.144、0.192、0.240 mg/mL，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样测定，以质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=13 076 004.17X-12 390.2（r=0.999 8），表明丹酚酸B浓度在0.24～1.2 mg/mL范围内线性关系良好。
　　2.1.6  精密度试验
　　精密吸取“2.1.2”项下对照品贮备液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得丹酚酸B峰面积RSD=0.82%，表明仪器精密度良好。
　　2.1.7  重复性试验
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下色谱条件进样，计算得丹酚酸B峰面积RSD=1.73%，表明本方法重复性良好。
　　2.1.8  稳定性试验
　　精密吸取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件下分别于制备后0、6、8、12、24、48 h测定，计算得丹酚酸B峰面积RSD=1.17%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
　　2.1.9  加样回收率试验
　　取丹酚酸B含有量已知的供试品溶液6份，精密加入丹酚酸B对照品适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果平均回收率为97.57%，RSD=1.12%，表明加样回收率良好。
　　2.2  总多糖含量测定
　　2.2.1  对照品溶液的制备
　　取D-无水葡萄糖对照品适量，加入超纯水使其充分溶解，作为对照品贮备液（浓度为0.096 0 mg/mL）。
　　2.2.2  供试品溶液的制备
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，按拟定的试验方案提取，备用。
　　2.2.3  苯酚溶液的制备
　　精密移取5 g苯酚溶液，用温水溶解制成5%苯酚溶液，置于棕色量瓶中，低温避光密封保存。
　　2.2.4  最大吸收波长的确定
　　精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0.5 mL，供试品溶液0.1 mL，分别置100 mL量瓶中，加入超纯水定容稀释，充分摇匀后吸取稀释液0.1 mL，置于10 mL试管中，用超纯水补至1 mL，各加5%苯酚溶液1 mL及浓硫酸溶液5 mL，混匀，静置10 min，放入沸水浴加热20 min后取出，迅速冷却至室温，以相同方法制备空白液后进行测定，在210～800 nm波长区域扫描，结果见图2。可见，在490.8 nm波长处，对照品及供试品溶液均有最大吸收[9]。
　　2.2.5  标准曲线的制备
　　分別精密吸取“2.2.1”项下对照品贮备液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，按上述显色方法分别测定其吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，D-无水葡萄糖浓度（C）为横坐标，得回归方程A=0.788C-0.069 4（r=0.999 7），结果表明D-无水葡萄糖在0.028 8～0.067 2 mg范围内呈良好的线性关系。
　　2.2.6  精密度试验
　　精密吸取适量D-无水葡萄糖对照品溶液，按上述方法显色后连续测定6次，得到RSD=0.25%，表明仪器精密度良好。
　　2.2.7  重复性试验
　　按拟定的试验方案平行制备供试品溶液6份，在490.8 nm波长处测定按“2.2.4”项下方法显色后的吸光度，得到RSD=1.05%，表明本方法重复性较好。
　　2.2.8  稳定性试验
　　精密移取0.1 mL按上述方法制备的供试品溶液，分别于制备后0、40、80、120、160、200、240 min按上述方法显色，测定吸光度，结果RSD=0.343 9%，表明供试品溶液在4 h内较稳定。
　　2.2.9  加样回收率试验
　　取已知D-无水葡萄糖浓度的供试品溶液，取样品与对照品含量为l∶1平行制备6份待测溶液，按上述方法显色并测定其吸光度，结果平均加样回收率为100.17%，RSD=0.48%，表明加样回收率良好。
　　2.3  浸膏得率测定
　　将50 mL水提液精密吸取至已干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干后放入105 ℃烘箱内干燥3 h，置于干燥器冷却30 min，迅速精密称定质量，计算其浸膏得率[10]。浸膏得率（%）=浸膏质量×供试品溶液体积÷提取药物饮片的总质量×移取供试品溶液体积×100%。
　　2.4  提取工艺研究
　　以浸泡时间、加水倍量和提取时间为自变量，以丹酚酸B、总多糖含量和浸膏得率的综合评分为因变量，根据评价指标对水提工艺的影响拟定权重，以综合评分作为提取效果的评判依据。根据各指标对水提工艺的影响，给予丹酚酸B含量40%的权重比例，总多糖含量和浸膏得率各给予30%的权重比例，分别测定各指标成分含量并计算综合评分。即：丹酚酸B含量评分=丹酚酸B含量÷最大丹酚酸B含量×40，总多糖含量评分=总多糖含量÷最大总多糖含量×30，浸膏得率评分=浸膏得率÷最大浸膏得率×30，综合评分=丹酚酸B含量评分+总多糖含量评分+浸膏得率评分。 　　2.4.1  单因素试验
　　分别对提取次数、浸泡时间、加水倍量、提取时间进行单因素试验，根据单因素试验结果来确定Box-Behnken响应面试验的因素水平范围[11]。
　　2.4.1.1  提取次数考察
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，将浸泡时间固定为0.5 h，加水倍量固定为10倍，提取时间固定为1 h，依次考察提取1、2、3次的结果，测得综合评分呈递增趋势（见图3），故最佳提取次数为3次。
　　2.4.1.2  浸泡时间考察
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，将提取次数固定为1次，加水倍量固定为10倍，提取时间固定为1.0 h，依次考察浸泡0.5、1.0、1.5、2.0 h的综合评分，结果测得浸泡时间为1.0 h时综合评分最高（见图4）。故选择最佳浸泡时间为1.0 h，将浸泡0.5、1.0、1.5 h作为响应面设计范围。
　　2.4.1.3  加水倍量考察
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，将提取次数固定为1次，浸泡时间固定为0.5 h，提取时间固定为1.0 h，依次考察加水6、8、10、12倍的综合评分。当加水倍量为10倍时，综合评分最高（见图5），故选择最佳加水倍量为10倍，将8、10、12加水倍量作为响应面设计范围。
　　2.4.1.4  提取时间考察
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，将提取次数固定为1次，浸泡时间固定为0.5 h，加水倍量为10倍，依次考察提取0.5、1.0、1.5、2 h的综合评分，当提取时间为1 h时，综合评分达到最高（见图6），故选择最佳提取时间为1.0 h，将提取时间0.5、1.0、1.5 h为响应面设计范围。
　　2.4.2  Box-Behnken响应面试验
　　称取处方中拟水提的药物饮片91 g，提取次数固定为3次，以浸泡时间、加水倍量和提取时间为考察指标进行Box-Behnken响应面设计，试验因素与水平见表1。采用Design-Expert8.0.4软件设计试验方案，结果见表2，方差分析见表3，响应面图见图7。
　　2.4.3  模型拟合
　　采用方差分析对表2数据进行回归分析，得到回归方程Y=90.55-0.56A+5.31B+2.67C+4.22AB+4.10AC+2.27BC-9.13A2-8.34B2-4.16C2。从表3方差分析结果可以看出：B因素及因素之间的交互影响AB、AC、A2、B2、C2对综合评分具有显著影响，其影响程度为B>C>A;失拟项P>0.05，说明失拟不显著，因此所得回归方程能较好地分析及预测该研究的水提工艺。
　　2.4.4  验证试验
　　通过回归方程进行数据分析，得到最佳提取工艺条件为：称取处方中拟水提的物饮片91 g，浸泡时间为1.10 h，加10.88倍量水，提取1.27 h。结合实际生产和成本节约，确定最佳工艺为：称取处方中拟水提的药物饮片9 g，浸泡时间为1.00 h，加11.00倍量水，提取1.20 h。按优选的提取工艺进行3次验证试验，结果综合评分为90.54，与预测值（92.38）接近，且丹酚酸B转移率为72.46%，总多糖转移率为84.37%，表明该模型预测性较好，可用于优化健脾祛湿丸的水提工艺[12]。
　　3  讨论
　　银屑病是一种多基因遗传背景下T细胞异常的免疫性慢性皮肤病。中药治疗具有不良反应少、效果良好等优点，故在免疫性疾病的治疗中受到越来越多的关注。中药多糖对巨噬细胞、T细胞均有明显调节作用[13]。薏苡仁多糖可显著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数[14];茯苓多糖可在炎性疾病中激活T细胞向Treg分化，调节机体的免疫失衡[15-16];丹参多糖可显著抑制诱导型一氧化氮合酶、干扰素-α及白细胞介素-1β基因表达，具有保护机体免受细胞因子过量表达而受到损伤的作用，显示出较好的免疫调节活性[17];甘草多糖可诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮，避免脂多糖干扰，从而发挥免疫调节作用[18]。
　　健脾祛湿丸方中丹参的有效成分包括脂溶性与水溶性两部分。以丹参酮为代表的醌类化合物为主要的脂溶性成分，丹参酮类化合物具有脂溶性高、半衰期短和生物利用度低等缺点，故临床应用受到限制。酚酸类是主要的水溶性成分，且以丹酚酸B含量最高，在丹参的功效作用中占有重要地位，故以其作为指标性成分。本研究参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）丹参项下HPLC测定方法，以乙腈- 0.1%磷酸（22∶78）作为流动相对丹酚酸B含量进行测定，发现分离度不符合要求，故将流动相比例调整为21∶79。
　　本研究在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面法优化健脾祛湿丸水提工藝，所建立的模型预测性较好，最佳提取工艺为：浸泡1 h，加11倍量水，回流提取3次，每次1.20 h。
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　　（收稿日期：2018-09-17）
　　（修回日期：2018-10-08;编辑：陈静）
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