响应面法优化针叶樱桃黄酒的发酵工艺

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　　摘  要  以针叶樱桃和粳米为原料，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面法对针叶樱桃黄酒发酵工艺进行优化。结果表明，在酒曲添加量0.8%、糖化温度31 ℃、糖化时间68 h、酿酒酵母添加量0.8%、液料比为1.1∶1、针叶樱桃果浆添加量33%、发酵温度26 ℃、发酵时间4 d时为最佳发酵工艺参数。该最佳酿造工艺条件下，研制得针叶樱桃黄酒的色泽橙黄，清亮透明，特征香气浓郁，口感醇厚柔和，酒精度13.8% vol，感官评分96.4。果粮混酿酒一直是热带水果酿酒的发展方向。酿制针叶樱桃黄酒，开发黄酒新品种，对丰富市场具有重要的现实意义。
　　关键词  针叶樱桃;黄酒;发酵工艺;响应面法
　　中图分类号  S31      文献标识码  A
　　Abstract  The Box-Behnken response surface method was used to optimize the fermentation process of yellow wine from acerola cherry and rice on the basis of single factor experiments. The best fermentation conditions were as follows： koji addition 0.8%， saccharification temperature 31 ℃， saccharification time 68 h， Saccharomyces cerevisiae 0.8%， liquid to material ratio 1.1： 1（mL： g）， acerola cherry 33%， fermentation temperature 26 ℃， and fermentation time 4 d. Under the best fermentation conditions， the yellow wine produced had orange color， clear and transparent characteristics， harmonious and fragrant aroma， soft and mellow taste， alcohol content 13.8% vol， and the sensory evaluation score was 96.4. Fruit and grain blending is the development direction of the wine making for tropical fruits. The production of yellow wine from acerola cherry and rice would be of importance both in the development of new varieties of fruit wine and marketing.
　　Keywords  acerola cherry （Malpighia glabra）; yellow rice wine; fermentation process; response surface method
　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.022
　　针叶樱桃（acerola cherry， Malpighia glabra）原产于热带美洲西印度群岛加勒比海地区，又名“西印度樱桃”，被誉为“天然维C果王”[1]。20世纪50年代后，在我国引种栽培成功[2]。针叶樱桃营养丰富，含有多种维生素及矿物质，其中鲜果中维生素C的含量高达至1215～3024 mg/100 g，是含量最高的天然维生素C源之一[3-4]。维生素C是维持人体生命活动不可缺少的成分，水溶性维生素C参与了人体多种代谢过程，对于维持细胞完整、预防感染、增强抵抗力等方面有著重要的临床意义[5]。维生素C还能有效的保护维生素A、E、不饱和脂肪酸等抗氧化剂，防止自由基对人体的伤害，从而达到延缓衰老的效果[6-7]。黄酒是以稻米、小米、玉米、小麦等为主要原料，经蒸煮、加曲、糖化、发酵等工序制成的酿造酒[8]。黄酒是我国特产，享有“国酒”之美誉，也是世界上最古老的酒类之一[9]。由于它的酒度适中，酒香浓郁，口味独特，营养丰富，具有食疗价值，且易被人体吸收利用，故被称为“液体蛋糕”[10-11]。近年来人们的保健意识不断增强，对具有保健功效的低度酒类的需求不断提高，黄酒因具有营养、绿色、保健等特点而备受青睐，因而风味黄酒的开发展现出较大的市场潜力[12-14]。
　　针叶樱桃不耐贮藏、易腐烂，而目前针叶樱桃深加工产品开发较少，主要产品是糖果。所以，针叶樱桃黄酒的研制，对丰富黄酒品种与利用针叶樱桃有较为重要的意义。针叶樱桃黄酒是在传统黄酒的基础上，添加含维生素C极高的针叶樱桃而制成的果粮混酿型黄酒，与传统黄酒相比，针叶樱桃黄酒不仅风味独特，酒体的针叶樱桃果香和米酒香协调浓郁，满足了现代人群的口味要求，而且酒体中天然维生素C含量丰富，维生素C与黄酒的有效结合，使酒体营养成分丰富，符合现代人群的养生消费理念。针叶樱桃黄酒风味和营养上的独特性，使其具有巨大的推广潜力。本研究以针叶樱桃和粳米为主要原料，研究针叶樱桃黄酒酿造工艺技术，制成风味独特的果粮混酿型黄酒，对提升黄酒的价值，推动风味黄酒的发展有重要意义。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  材料与试剂  针叶樱桃（acerola cherry）：采摘自海南省定安县，果中可溶性固形物含量为9.7%，pH为3.9;粳米：市售;甜酒曲：安琪酵母股份有限公司;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：海南大学实验室菌株FP-8。 　　试剂：酒石酸钾钠、无水硫酸铜、葡萄糖、次甲基蓝、盐酸、甲基红、氢氧化钠、2，6-二氯靛酚钠等均为分析纯，广州化学试剂厂。
　　1.1.2  仪器与设备  SW-CJ-17-D型超净工作台，苏州佳宝净化工作设备有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;JYL-Y11型高速破壁打浆机，九阳股份有限公司;GJJ-0.1/25型高压均质机，上海台驰轻工装备有限公司;YM50FGN型全自动高压灭菌锅，上海沪誉贸易有限公司。
　　1.2  方法
　　1.2.1  酵母种子液制作  酵母菌种活化：无菌条件下挑取保存原菌接种于PDA斜面的试管中，28 ℃培养48 h。
　　酵母一级种子液：无菌条件下挑取活化酵母接入到盛有10 mL YPD液体培养基的大试管中，振荡均匀后28 ℃培养24 h;酵母二级种子液：将取10 mL酵母一级种子接入到盛有100 mL YPD液体培养基三角瓶中，振荡均匀后28 ℃培养24 h;酵母三级种子液：将取100 mL酵母二级种子接入到盛有1000 mL培养基（YPD∶针叶樱桃汁=1∶1）的三角瓶中，振荡均匀后28 ℃培养24 h，备用。1.2.2  针叶樱桃黄酒的加工工艺流程及操作要点  工艺流程：
　　操作要点：挑选无腐烂、无破损、无病虫害的针叶樱桃果，用流动水洗涤，采用打浆机低温原果打浆，制得针叶樱桃果浆备用（针叶樱桃果浆中，可溶性固形物含量为9.7%，pH 3.9）。称取适量粳米，淘洗后于室温下浸泡24 h。将浸泡好的粳米进行蒸煮，蒸煮后用凉开水冲淋至室温，加0.8%的甜酒曲（按粳米干质量计算），在31 ℃条件下糖化68 h。在针叶樱桃黄酒糖化工艺条件的基础上，研究后续酿酒酵母发酵工艺对针叶樱桃黄酒品质的影响。糖化结束后，加水冲缸（液料比=水的体积/粳米干质量），接种酵母菌，加入针叶樱桃果浆（比例按粳米干质量计算）进行发酵。发酵结束后，经澄清、过滤、封缸陈酿使其风味趋以完善，最后，根据针叶樱桃果的特性，采用超高温110 ℃杀菌15 s，再迅速降温，得产品[4， 12]。
　　1.2.3  发酵单因素实验  酿酒酵母发酵的基础工艺条件：首先进行黄酒的糖化工艺，加曲量为0.8%（按粳米干质量计算），在31 ℃条件下糖化68 h。糖化结束后，添加酵母菌，进行酿酒酵母发酵。工艺条件为酵母菌添加量为0.8%，发酵温度28 ℃，针叶樱桃果浆添加量30%（按粳米干质量计算），液料比1∶1（纯净水/粳米干质量），发酵时间5 d。
　　单因素实验条件：根据酿酒酵母发酵的基础工艺条件，采用单一变量进行试验。以感官评分、酒精度为评价指标，依次研究酵母菌添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、发酵时间（1、2、3、4、5 d）、针叶樱桃添加量（0、15%、30%、45%、60%）、液料比（纯净水/粳米干质量：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）、发酵温度（20、24、28、32、36 ℃）对针叶樱桃黄酒品质的影响。按1.2.4中的方法进行评价。
　　1.2.4  发酵响应面优化实验设计  在单因素实验的基础上，以感官评分（Y）为响应值，进行响应面优化实验，确定针叶樱桃黄酒的最佳发酵工艺参数。响应面实验因素和水平见表1。
　　1.2.5  测定方法  针叶樱桃黄酒感官评分标准：选择10名食品专业人员，参照GB/T 13662-2008《黄酒》的方法，从外观、香气、口味、风格四个方面制定感官评分标准，进行感官评分，满分为100分。感官评分标准见表2。
　　酒精度、总糖、总酸（以乳酸含量计）、氨基酸态氮、pH：均参照GB/T 13662-2008《黄酒》中规定的检测方法进行测定;维生素C：参照GB 5009.86-2016《食品中抗坏血酸的测定》中规定的检测方法进行测定;菌落总数：参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》中规定的检测方法进行测定;大肠杆菌：参照GB 4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》中规定的检测方法进行测定。
　　2  结果与分析
　　2.1  针叶樱桃黄酒发酵工艺单因素实验
　　2.1.1  酿酒酵母添加量对针叶樱桃黄酒品质的影响  由图1可知，酿酒酵母添加量为0.8%时，得到的针叶樱桃黄酒果香和酒香醇厚浓郁，酒体组分协调丰满，风味最佳，感官评分达到最大值92分，此刻酒精度为13.2% vol。酿酒酵母添加量少时，针叶樱桃黄酒的发酵缓慢，容易导致杂菌生长，发酵产生的酒精度较低，导致针叶樱桃黄酒的果香和酒香香气淡薄，风味不够协调[15];酿酒酵母添加量过高时，酵母菌为了生存竞争营养物质，酵母菌的发酵受到抑制，酒精度不高，杂菌繁殖，酸味与苦涩味變得突出，针叶樱桃黄酒果香和酒香香味淡薄，感官评分降低[15]。故最佳酵母菌接种量为0.8%。由于在整个发酵工艺优化过程中酵母添加量对黄酒感官评分的影响较其他因素而言并不明显，故而酵母添加量在响应面实验中不作为考察对象。
　　2.1.2  发酵温度对针叶樱桃黄酒品质的影响  针叶樱桃对温度敏感，虽然低温有利于针叶樱桃黄酒的酿造并提升针叶樱桃黄酒品质，但发酵温度低，酵母菌发酵时间会延长;随着发酵温度的增加，针叶樱桃黄酒的果香和酒香变得越来越协调浓郁，口感越来越丰满协调;当发酵温度达到24 ℃时，感官评分最高;当发酵温度超过24 ℃后，随着发酵温度的升高，发酵速度逐渐加快，生成较多的副产物，针叶樱桃黄酒的果香和酒香香味不足，酒香和果香不协调，酒体中的异杂味越来越突出，使针叶樱桃黄酒的整体风味变差[16]，故发酵温度24 ℃较为适宜（图2）。 　　2.1.3  液料比对针叶樱桃黄酒品质的影响  图3所示，当液料比为1.0时，感官评分分别达到最大值为95分，酒精度为13.8% vol。水添加量过少时，针叶樱桃黄酒发酵液过于黏稠，不利于糖化液的发酵，而当水添加量过大时，发酵液被稀释，营养成分含量不足[13]。这两者都导致发酵完成后酒精度过低，也因此影响针叶樱桃黄酒品质，致使针叶樱桃黄酒的果香和酒香香气成分不协调，感官评分降低;当液料比为1.0时，果香和酒香醇厚浓郁，风味协调，故液料比为1.0时比较适宜。
　　2.1.4  针叶樱桃果浆添加量对针叶樱桃黄酒品质的影响  由图4可知，随着针叶樱桃果浆添加量的增加，针叶樱桃的风味越来越突出，果香和酒香变得越来越协调浓郁，酒体组分变得丰满协调，感官评分逐渐增加;在针叶樱桃添加量15%时，酒精度达到最大值13.7% vol，但是由于针叶樱桃添加量较少，果香和酒香不够协调浓郁，酒体组分不够丰满协调;在针叶樱桃添加量30%时，针叶樱桃黄酒的感官评分达到最大值93分，酒精度为13.3% vol。而后随着针叶樱桃果浆添加量的增加，针叶樱桃黄酒的果香越来越凸显，但同时在针叶樱桃果浆的稀释作用下，酒香则显得不足，整体风味不够协调浓郁，感官评分降低。因此，选择最佳针叶樱桃果浆添加量为30%。
　　2.1.5  发酵时间对针叶樱桃黄酒品质的影响  随着发酵时间的延长，针叶樱桃黄酒的酒香越来越浓郁，果香和酒香越来越和谐，感官评分越来越高，当发酵时间达到4 d后，由于酒体中大部分的糖已被酵母菌转化为酒精[12]，果香和酒香醇厚浓郁，酒体组分丰满协调，针叶樱桃黄酒的感官评分趋于平稳;而发酵时间继续延长，苦味和涩味物质会逐渐凸显，不利于针叶樱桃黄酒风味的形成。故最佳发酵时间为4 d。实验结果见图5。
　　2.2  响应面优化针叶樱桃黄酒发酵工艺试验结果及分析
　　2.2.1  数字模型的建立及分析  结合单因素实验结果，进一步优化针叶樱桃黄酒的发酵工艺条件。选取液料比（A）、针叶樱桃果浆添加量（B）、发酵温度（C）为影响因子，以感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面实验。Box-Behnken实验结果见表3。通过Design Expert 8.0.6.1软件对表3进行回归分析，方差分析结果见表4。
　　对表3中的试验结果进行多元回归拟合后，获得各因素水平对针叶樱桃黄酒感官评分（Y）影响的二次多项回归模型：
　　Y=95.20+0.88A+2.00B+3.38C1.00AB+2.25AC+0.50BC5.23A24.98B24.22C2
　　由表4可知，上述建立的回归模型极显著（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.1097>0.05）。表明针叶樱桃黄酒发酵工艺数据模型的选取具有合理性;模型决定系数R2为0.9776，校正决定系数R2Adj为0.9489，表明该模型与试验结果的拟合度较好，可以用此模型对叶樱桃黄酒的发酵工艺参数进行可靠分析和预测。根据表4中F值判断，各因素对针叶樱桃黄酒发酵工艺感官评分的影响大小顺序为：发酵温度>针叶樱桃果浆添加量>液料比，其中一次项B、C达到极显著水平（P<0.01），AC的交互作用为极显著（P<0.01），二次项A2、B2、C2对针叶樱桃黄酒感官评分的影响极显著（P<0.01）。综合数据结果表明，该模型能较好地反映发酵温度、针叶樱桃添加量、液料比之间的关系，因此所得的回归方程能较好地预测针叶樱桃黄酒发酵工艺中感官评分在不同条件下的变化规律。
　　2.2.2  影响因子间交互作用分析  通过应用Design-Expert. V 8.0.6软件获得针叶樱桃黄酒发酵工艺的响应面图和等高线图，能够直观地反映出各因素及其相互作用对实验结果的影响。响应面图的曲面程度越大，表明两因素间的交互作用越显著[17]。由图6可直观地反映出针叶樱桃添加量、发酵温度和液料比之间的交互作用对总糖和总酸的影响程度。液料比和发酵温度的交互作用对针叶樱桃黄酒感官评分的影响显著（P<0.05），其余因素间交互作用影响不显著（P>0.05），这与方差分析结果一致。
　　2.3  针叶樱桃黄酒发酵工艺验证实验
　　通过软件对所建立的发酵工艺模型进行分析，获得酿造针叶樱桃黄酒最佳发酵工艺条件为液料比1.08∶1，针叶樱桃添加量33.11%，发酵温度25.82 ℃。为了实际操作的可行性，将最佳发酵工艺参数修正为液料比1.1∶1，针叶樱桃添加量33%，发酵温度26 ℃。在此发酵工艺条件下进行3组平行验证实验。得到的结果为感官评价得分96.4与预测值96.2458分相近，说明本实验的回归模型方程具有实际指导意义。
　　2.4  产品质量指标
　　应用响应面优化后的最佳条件进行发酵，检测发酵后针叶樱桃黄酒的各项指标为：酒精度（温度为20 ℃时）为13.8% vol;总糖为44.1 g/L;酸度为7.3 g/L;pH为3.8;氨基酸态氮为0.39 g/L;维生素C含量为132.0 mg/100g;菌落总数<1 CFU/mL。产品各项指标均符合国家标准。
　　3  討论
　　目前，关于传统黄酒的工艺研究报道较多，但对针叶樱桃果粮混酿型黄酒的工艺研究尚未见报道。对于黄酒的传统工艺研究，黄瑶等[18]对不同工艺酿制的黄酒进行了比较，研究表明，使用纯菌种先糖化后发酵工艺酿造的黄酒品质最佳。本研究采用纯菌种先糖化后发酵的酿造工艺酿造针叶樱桃黄酒。
　　与传统黄酒酿造工艺[19]相比，本研究在传统黄酒酿造工艺的基础上，将针叶樱桃和黄酒结合，也是天然维生素C与黄酒的结合，使酿造的针叶樱桃黄酒具有独特的风味和营养;传统黄酒酿造工艺的酿造温度一般在30 ℃左右，崔闯等[12]研究黄酒的发酵温度为32 ℃，本研究采用先在31 ℃糖化，然后在26 ℃进行后发酵的发酵模式，且在添加酿酒酵母时加入辅料针叶樱桃果浆。针叶樱桃果香和维生素C受温度影响较大[4]， 添加针叶樱桃果浆后低温发酵，可减缓维生素C的氧化，有利于发酵后针叶樱桃新鲜果香风味的形成。 　　本研究在单因素的基础上，选取对针叶樱桃黄酒品质影响最大的因素，对发酵工艺进行响应面优化试验。最终确定针叶樱桃黄酒发酵工艺的最优参数为：加曲量0.8%，酵母添加量0.8%，液料比1.1∶1，针叶樱桃添加量33%，发酵温度26 ℃，发酵时间4 d，制得的针叶樱桃黄酒呈橙黄色，清澈透明，有光泽，酒体协调，醇厚绵长，甘甜爽口，具有针叶樱桃黄酒的典型风格，得出的最优针叶樱桃黄酒酿造工艺具有较好的实际应用价值，对带动针叶樱桃的规模化生产和丰富黄酒的品种有重要的实际意义。
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