土生鳞伞液体发酵工艺条件的优化研究

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　　摘  要：为了提高土生鳞伞菌丝体的产量，在单因素试验基础上，考察培养温度、摇床转速、培养时间和培养基起始pH对菌丝体干质量的影响，并通过Box-Behnken试验设计和响应面分析法确定土生鳞伞液体发酵最佳工艺条件，对影响土生鳞伞（Native scale umbrella）菌丝生长的关键影响因子最佳水平范围进行研究和探讨。结果表明，土生鳞伞菌丝产量发酵培养条件的最佳组合是：温度25℃，摇床转速180r/min，培养时间9d，pH7，菌丝产量实测值为40.332g/100mL。此研究结果可为土生鳞伞液体发酵的试验生产提供理论依据。
　　关键词：土生鳞伞;响应曲面法;优化;发酵
　　中图分类号 X523   文献标识码 A   文章编号 1007-7731（2019）09-0029-5
　　Abstract：In order to increase the mycelium yield of Umbrella lucidum，the effects of initial pH，culture time，rotating speed of shaker and culture temperature on the mycelium dry mass were investigated on the basis of single factor experiment.The optimum technological conditions of liquid fermentation of Umbrella lucidum lucidum were determined by Box-Behnken design and response surface methodology.The optimum level range of the key factors affecting the mycelial growth of ative scale umbrella was studied and discussed.The results showed that the mycelial yield of native umbrella was fermented.The optimum combination of culture conditions was （100 mL）： pH;temperature;rotating speed of shaker;culture time;measured value of m ycelium yield.The mycelium yield of the optimized native umbrella was higher than that before optimization.The results could provide theoretical basis for the experimental production of liquid ferme ntation of native umbrella.
　　Key words：Native scale umbrella;Response surface method;Optimize;Fermentation
　　绝大数真菌活性物不仅留存在子实体，也可留存在发酵液和菌丝体中，特别是高等担子菌已变为人们探求新活性物的一个主要来源[1]。土生鳞伞（Native scale umbrella）又名地鳞伞，鳞环锈伞等，该菌种的主要特征为：子实体小型，丛生;菌盖表面淡褐色;反卷较大的暗色鳞片在菌中部;菌肉为浅茶色至茶色的厚片，味道与气味平淡。有关伞菌能够增强免疫力、抗氧化和抗癌存在一部分的报道[2]，本实验采用Box—Behnken响应曲面法联合优化液体发酵培养基，通过改进土生鳞伞菌的培养条件进一步优化菌落，调节培养温度、转速、培养时间和初始pH，探究土生鳞伞液体发酵的最适条件，为土生鳞伞液体发酵的最佳生产供给理论依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 供试菌种 土生鳞伞。
　　1.2 仪器 电子天平（JA51001型）：上海天美天平儀器有限公司;酸度计（PHS-3C型）：上海精密科学仪器有限公司;恒温摇床（HNY-211C型）：天津欧诺仪器股份有限公司;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A型）：上海一恒科技有限公司;BBS-DDC型超净工作台：山东博科科学仪器有限公司;摇瓶;培养皿等玻璃器皿。
　　1.3 试剂材料 葡萄糖、琼脂、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、HCl。
　　1.4 培养基 PDA斜面培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。首先将土豆除皮后切开，煮至沸腾约20min，用干净纱质布料过滤后加入葡萄糖与琼脂[3]，溶化以后补水到1000mL，在121℃条件下[4]灭菌20min。
　　完全培养基（CM）：蛋白胨1.0%，葡萄糖2.0%，酵母膏0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.1%，pH值未调节。
　　1.5 方法
　　1.5.1 菌种的活化 将土生鳞伞菌养育在PDA斜面培养基于4℃冰柜内留存，传代1次时长为30d。菌苗传代或活化菌苗步骤为：取土生鳞伞菌丝块接种于PDA斜面培养基上，25℃条件养育7d[5]。取5块长宽约2cm菌块在培养基上（装液量为100mL/250mL），静止培养24h，再以转速180r/min震荡培养7d。将培育成功的土生鳞伞种子液按实验设计的接种比例加入至发酵培养基内（100mL培养液装入250mL摇瓶，加入10%的一级种子液，将转速调为180r/min，26～27℃条件下培育5～6d），进行相应的优化实验[6]。 　　1.5.2 培养温度 将最适培养液100mL添加进250mL摇瓶，121℃高温灭菌20min，再接入10%的一级种子液，存放于恒温摇床上，温度设成22、25、28、31、34℃，每个温度设3组相同，培养9d后测定菌丝体产量，得出最适的培养温度[7]。
　　1.5.3 转速 将最适培养液100mL添加至250mL摇瓶，121℃高温灭菌20min，再接入10%的一级种子液，放于恒温摇床上，转速设成120、150、180、210、240r/min，每个转速设3组相同，培养9d后测定菌丝产量，得出最适的转速[8]。
　　1.5.4 培养时间 将最适培养液100mL添加至250mL摇瓶，121℃高温灭菌20min，再接入10%的一级种子液[8]，放置于恒温摇床上，培养时间设成5、7、9、11、13d，每个培养时长设3组相同，培养9d后测定菌丝产量，得出最适的培养时间。
　　1.5.5 起始pH 将最适培养基100mL添加至250mL摇瓶，121℃高温灭菌20min，再接入10%的一级种子液[8]，用10%的NaOH和HCl调节培养基的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，每个pH设3组相同，培养9d后去测菌丝产量，得出最适的培养pH。
　　1.5.6 土生鳞伞培养条件的Box—Behnken试验设计 优化土生鳞伞液体发酵采取响应面曲线法，由单要素的实验成果，使用Design—expert8.0.6软件系统，Box- Behnken响应面法，自变量是培养温度、转速、培养时间和起始pH[9]，响应值是菌丝体干重，为拟和因素与指标间函数的关系，设计4因素3水平的二次回归方程，具体试验设计见表1，确定有关土生鳞伞液体发酵培养的最佳工艺。
　　1.5.7 菌丝体干重的测定 在结束养育后，用300目的滤网过滤100mL发酵液，用蒸馏水多次洗涤过滤菌丝球后[10]，在恒温鼓风干燥箱内干燥，用天平称取重量即得菌丝重。
　　2 结果与分析
　　2.1 温度对土生鳞伞菌丝体量的影响 由图1可知，菌丝体成长在不同培养温下有差异，随着温度的增加土生鳞伞菌丝产量不断增多[11]，到最高重量36.10g/100mL时为25℃，之后随温度上升，菌丝产量下降，菌丝体产量最少是在31℃，说明25℃最有利于土生鳞伞菌丝体的生长。
　　2.2 转速对土生鳞伞菌丝体量的影响 由图2可知，在不同转速下菌丝体生长存在差异，转速在150r/min菌丝体干重最大为37.14g/100mL，可能是因为含氧量在发酵中对土生鳞伞菌丝的成长有影响[11]，在一定转速水平，转速越大，菌液中溶氧量越高，越有利于菌丝生长;但转速过大又会破坏菌丝结构，影响其生长。在150r/min时，土生鳞伞发酵的菌丝体干重最重。
　　2.3 培养时间对土生鳞伞菌丝体量的影响 由图3可知，不同培养时间菌丝体生长在存在差异，养育9d菌丝体干质量达到最大25.30g/100mL;说明土生鳞伞菌丝体的干重随发酵时长增加呈现增多的改变[12]，9d为选择的最佳培养时间。
　　2.4 起始pH土生鳞伞菌丝体干重的影响 由图4可知，在不同起始pH下菌丝体成长有差异，培养起始pH为6，菌丝体干质量最多为25.5g/100mL;说明在一定的pH范围内，土生鳞伞干重随pH的增加而增多[13]，pH为6是最佳养育起始pH。
　　2.5 Box—Behnken试验设计
　　2.5.1 模型的建立与显著性检验 由单要素试验的结果，选4个要素分别是培养温度、转速、培养时间和起始pH，通过4要素3水平Box—Behnken实验和响应面法。设计29组实验，估计试验误差采取5次中心试验，表2是具体组合和试验值。菌丝体干重（Y）为响应值，Design Expert多元回归拟合分析，如下多元二次回归方程表示各要素对响应值影响：菌丝产量Y=+29.04+6.40×A+1.59×B+5.63×C+5.50×D-3.35×A×B+6.47×A×C+8.02×A×D+5.41×B×C+3.06×B×D+4.89×C×D-2.10×A2-10.81×B2-4.65×C2-7.87×D2
　　土生鱗伞菌丝体干重整体模型P<0.01，显示该二次方程模型是极显著水平，说明该方程对试验拟合较好。根据回归方程，做出响应曲面，考察拟合响应曲面的形状，分析培养温度、转速、培养时间和起始pH对土生鳞伞菌丝体的影响，结果见图5。
　　2.5.2 最佳工艺条件的预测与检验 土生鳞伞液体发酵最佳工艺由回归模型预测：菌丝产量最大值为40.332g/100mL时，培养温度为25℃，转速为150r/min，培养时间为9d和起始pH为7。为检验最佳工艺条件的可靠性，培养前提同上后，进行验证试验，得菌丝体的实际值为40.247g/l00mL，说明二次回归方程与实践情况拟合较好。
　　3 结论
　　通过单因素试验和Box—Behnken试验以及用响应面分析法建立的菌丝体干重与各单个要素间关系的回归模型，土生鳞伞液体发酵最佳条件是：温度25℃，转速180r/min，培养时长9d，pH7;菌丝干质量最重，为40.322g/100mL。对于各要素变量的二次回归方程模型来说，该模型回归极显著，对试验拟合较好，有一定使用价值，为土生鳞伞菌丝体生物活性的提取奠定了一定的基础。
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　　（责编：王慧晴）
　　基金项目：2017年地方高校省级大学生创新创业训练计划项目（201711305071）;2018年安徽省教育厅自然科学研究重点项目（KJ2018A0570）;2016年安徽省质量工程项目大学生创客实验室建设计划（2016ckjh118）。
　　作者简介：秦静（1998—），女，安徽泗县人，研究方向：食品生物技术。   *通讯作者     收稿日期：2019-03-30
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