粉托鬼笔菌液体培养基条件优化
来源:用户上传
作者:
摘 要：以粉托鬼笔菌菌丝体为实验材料，研究了在液体深层发酵过程中碳源、氮源、无机盐、培养条件对菌丝体生物量的影响，经过多个重复对比实验，分析实验数据，从而确定了粉托鬼笔菌液体深层发酵的最佳条件。为粉托鬼笔菌的深层发酵开发研究奠定了坚实的基础。
关键词：粉托鬼笔菌;液体深层发酵;菌丝体生物量
粉托鬼笔菌（Phallus impudicus L.ex Pers.），隶属于鬼笔目（ Phallales），鬼笔科（Phallaceae），鬼笔属（ Phallus），是一种大型真菌。贴生于菌柄的顶部并在菌柄顶部膨大部分相连，外表面有大而深的网格，成熟后顶平，有穿孔，孢子体覆盖在菌盖网格内表面，青褐色、黏稠、有草药样浓郁香气[1]。本实验室开展了培养基条件的优化实验，深入研究粉托鬼笔菌液体培养基条件优化。以获得大量的粉托鬼笔菌菌丝体，以满足粉托鬼笔菌药物开发的需要。
一、材料与方法
1.材料。菌种：粉托鬼笔菌（Phallus impudicus L.ex Pers.），鲁东大学菌物科学与技术研究院菌种保藏室保存。
2.培养基。斜面培养基（组分g/dL）：马铃薯20，葡萄糖2，蛋白胨2，酵母膏0.8，琼脂2，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.3。液体种子培养基（组分g/dL）：葡萄糖2，蛋白胨2，酵母膏0.8，MgSO4 0.3，KH2PO4 0.5。发酵基础培养基（组分g/dL）：浓度同液体种子培养基一样。
二、实验方法
1.摇瓶培养。从已活化的菌种斜面上挑取生长旺盛部位的菌丝体，挑取两块菌丝体接入到装有100 mL液体种子培养基的250 mL的三角瓶中，置于湿度适宜，温度为25℃的摇床上培养7d。按体积分数10%的接种量，将10 mL摇瓶种子液在无菌条件下接入到装有100 mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，25℃、150r/min条件下，摇瓶培养7d。
2.单因素筛选试验。碳源筛选实验：在基础培养基基础上以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、甘油、甘露醇六种碳源分别进行培养，得到各自的最适浓度，再在六种最适浓度碳源中得到最适的碳源，设2个重复，进行摇瓶发酵。氮源筛选实验：在基础培养基中分别以酵母粉、硝酸铵、氯化铵代替蛋白胨作为氮源，其添加量根据各自的全氮含量相对于0.5g/dL蛋白胨的全氮量折合而成，设2个重复，进行摇瓶发酵。
无机盐筛选实验：选用KH2PO4 、MgSO4 、CaSO4 、ZnSO4分别进行单因素实验，确定最适的浓度。
起始pH值筛选实验：用1mol/L NaOH 和1mol/L HCl调节发酵培养基的pH值，分别为4.5， 5.0， 5.5， 6.0， 6.5，7.0发酵结束测得菌丝体干重，得到发酵起始最佳pH。接种量选择实验：接种量选取5%、10%、15%、20%分别进行培养，确定最佳接种量。
三、结果与分析
1.碳源对粉托鬼笔菌深层发酵的影响。6种碳源均可被粉托鬼笔菌菌丝体利用，说明粉托鬼笔菌对碳源的要求并不苛刻，既能利用单糖和双糖等小分子碳源，也能利用成分复杂的复合碳源。以这6种碳源最适浓度进行单因子发酵，得到实验数据。可以得出以葡萄糖和可溶性淀粉为碳源时，菌丝体生物量最高，但考虑到葡萄糖价格低廉，且来源方便;同时葡萄糖作为一个速效碳源，可被菌体直接利用，能够缩短发酵延迟期。故选用浓度为2%的葡萄糖作为本试验的最适碳源。
2.氮源对粉托鬼笔菌深层发酵的影响。粉托鬼笔菌在含蛋白胨的培养基中能很好生长，而在含酵母粉的培养基中生长不良，在含氯化铵、硝酸铵的培养基中则不出现生长现象，说明粉托鬼笔菌对有机氮的利用比无机氮好。但培养基单独使用蛋白胨或酵母膏，菌丝体都会出现生长不良的现象，而二者一起使用的时候，菌丝体就能很好生长。故对蛋白胨和酵母膏分别进行浓度优化，得到蛋白胨最适浓度为2%，酵母膏最适浓度为0.8%。
3.无机盐对粉托鬼笔菌深层发酵的影响。分别对KH2PO4、MgSO4 、CaSO4 、ZnSO4进行单因素条件筛选，分析可知KH2PO4、MgSO4 、CaSO4对菌丝体生长有重要促进作用，而ZnSO4的存在与否对菌丝体产量没有影响，进而分别对KH2PO4、MgSO4 、CaSO4分组培养，得到最适浓度KH2PO4 0.6%、MgSO4 0.45%、CaSO4 0.2%。
4.起始pH值对粉托鬼笔菌深层发酵的影响。用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节发酵培养基的pH值，分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。起始pH值的选择结果，pH5.5时可促进菌丝体的生长，而发酵培养基的自然pH值偏酸，约为5.8，因此采用培养基的自然pH值5.8即可。
5.接种量对粉托鬼笔菌深层发酵的影响。接种量的选择结果为5%mL时，发酵前期菌丝体生长过于缓慢，导致发酵时间延长;接种量为15%、20%时发酵前期菌丝体生长过于旺盛，培养基营养成分迅速消耗，导致发酵后期菌丝体生长缓慢，不利于代谢产物多糖的生成;而接种量为10mL时，对菌丝体和多糖有明显促进作用，故接种量选择10mL。
6.粉托鬼笔菌摇瓶发酵过程中的动态变化。按照筛选出来的发酵培养基和培养条件进行摇瓶发酵，每隔1d取样测定生物量。经过10d的发酵，得出粉托鬼笔菌菌丝体干重和培养基pH值的变化曲线。菌丝体生物量在达到峰值，在衰亡期开始自溶，生物量开始下降。pH值变化曲线为先降后升，但一直都保持在5.5～6.0之间，这一数值正是粉托鬼笔菌生长的适宜pH值的范围。可以初步确定8d左右为发酵的终点时间。
7.条件优化设计小结。通过单因素试验，发现可溶性淀粉和葡萄糖是很好的碳源。酵母粉对菌丝体的生长有促进作用，黄豆粉作为一种复合氮源，来源方便，价格低廉，故作为粉托鬼笔菌液体发酵的主要氮源。微量元素方面，实验结果表明，添加微量的锌盐对菌丝体生物量没有影响。发酵的最优培养基组成为：葡萄糖2g/dL，蛋白胨2g/ dL，酵母膏0.8g/dL，KH2 PO4 0.6g/dL，MgSO4 0.45g/dL ，CaSO4 0.2g/dL ;最优培养条件为：24℃，起始pH5.8 ，摇瓶装液量为100mL/250mL ，接种量10mL ，摇床转数140r/min ，发酵时间为8d。
四、结語
通过单因素筛选实验，我们了解了在深层发酵过程中碳源、氮源、无机盐、培养条件等对菌丝体生物量的影响。分析整理实验数据，可以将得出的实验数据灵活的运用到生产实际中，为解决时间中的问题提供理论依据。 在粉托鬼笔菌液体培养条件研究成熟的基础上，可以考虑进行工厂化生产。
参考文献：
[1]王建瑞，图力古尔. 吉林省担子菌补记（六）[J]. 菌物研究.2004.2（ 4）： 40-43.
[3]程显好，田吉腾，张秋胜，王琦，冯志彬，朱林，图力古尔. 粉托鬼笔菌丝体和子实体的培养特性[J].第九届全国食用菌学术研讨会论文集.2010.
[3]欧超，李正鹏，王娣.羊肚菌液体深层发酵条件[J].食品与生物技术学报.2007.3.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-14902780.htm
