茄褐纹病菌的分离鉴定及培养基筛选

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　　摘  要：对茄褐纹病菌的形态及适宜培养基类型进行了分析，在茄子的不同发病部位分离出α型、β型2种分生孢子;实验结果显示，燕麦培养基是最适宜褐纹病菌产孢的培养基，其次为PSA。
　　关键词：茄褐纹病菌;分离鉴定;培养基;筛选
　　中图分类号 S436.411 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0074-03
　　褐纹病（Phomopsis vexans）是茄子重要的病害之一，主要危害茄子果实，影响果实的商品性。一般造成果腐发生率在20%～30%[1]，严重的高达80%[2，3]，茄子采种田因褐纹病的大发生而导致种子严重减产，甚至绝收。
　　茄褐纹病菌属半知菌亚门球壳孢目拟茎点霉属，病斑上产生的黑色分生孢子器初埋生于寄主表皮下，成熟后突破表皮而外露;孢子器单独地生子座上，呈凸透镜形，具有孔口，在自然状态下，Phomopsis的分生孢子器多数仅含有α-型孢而无β-型孢，年佳续[4]综合论述了拟茎点霉属的检测技术，认为形态学鉴定的传统方法仍是主要鉴定方法之一。罗利娟[5]对8种拟茎点霉在不同培养条件下的产孢情况进行了研究，以其解决自然条件下拟茎点霉属的鉴定问题。陈永青、姜子德[6，7]分别用分子生物学的方法对多种拟茎点霉属真菌进行了系统研究，结果表明，Phoma与Phomopsis两属之间缺乏明显的区分界限，在Phomopsis的分类地位上仍存在着界限模糊的问题。周永力[8]对Phomopsis的个体发育做了较为具体的阐述，主要涉及人工培养条件下的Phomopsis的产孢形式、孢子形态及菌落的生长特点等方面。油球是Phomopsis属的一个稳定的特征，可作为该属的判断依据。温度成为影响孢子类型产生不同的主要因素，传统观点认为，不同类型的孢子形态的产生是与所发病的植株部位有关，在自然状态下，Phomopsis的分生孢子器大多仅含有α-型孢而无β-型孢。本研究通过对采集样本的徒手切片、镜检，以及筛选适宜培养基等方法，在较短时间内用较为经济的手段，对茄褐纹病菌进行准确的初判，并对茄褐纹病菌的产孢条件进行了进一步研究。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 供试菌株 HA、HB采自安徽合肥，HY采自安徽和县。
　　1.1.2 供试培养基 PDA培养基。
　　1.2 仪器及试剂 光学显微镜，显微摄像显微镜 （OLYMPUS），解剖刀，镊子，剪刀，培养皿，载玻片，盖玻片，恒温箱。
　　1.3 实验方法
　　1.3.1 病原菌分离纯化 采用PDA培养基进行常规组织分离法，于25℃培养纯化，记录菌落的形态和颜色，同时对病组织进行徒手切片、镜检，观测病原菌形态。并按柯赫氏法则[9]加以确认，获得茄褐纹病菌菌株3株，分别编号HA、HB、HY。
　　1.3.2 培养基筛选
　　1.3.2.1 实验培养基的制备 （1）PSA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL;（2）PSA+VB1培养基：在原有PDA培养基成分中添加5mg维生素B1;（3）燕麦培养基：燕麦片30g，琼脂20g，水1000mL;（4）胡萝卜培养基：200g胡萝卜榨汁，25g琼脂，水1000mL;（5）大豆培养基：干豆140g浸泡数小时后磨浆榨汁，琼脂4g，水1000mL;（6）玉米培养基：玉米粉300g，琼脂17g，水1000mL;（7）蛋白胨培养基：蛋白胨5g，蔗糖10g琼脂14g，水1000mL;（8）查彼培养基：蔗糖30g，硝酸钠2g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂17g，水1000mL;（9）茄汁培养基：茄子200g榨汁，琼脂25g，水1000mL。
　　1.3.2.2 菌丝生长速率的测定 将茄褐纹病菌菌株HA、HB、HY分别在PDA斜面上活化3d，然后转移至PSA平板上培养5d。在培养好的菌落平板上沿菌丝生长边缘用打孔器打直径为6mm的小菌碟，分别移置不同培养基平板的中央，3次重复。25℃条件下恒温培养，3d后按十字交叉法测量菌落的直径，取平均值，测定生长速率。
　　2 结果与分析
　　2.1 茄褐纹病病原的鉴定 茄褐纹病菌存在2种分生孢子：α型及β型分生孢子。α-型孢子为单孢，无色、长圆柱形、球形、梭形，1端或2端较尖，有1～2个大油球或两端各聚集多个小油球。β型呈细长线状，并在一端弯曲成钩，两者均为无色单胞。经镜检得知，寄主发病部位不同，其分生孢子类型有明显差异：果实上分离的分生孢子有2种类型，其中多数为α型分生孢子，伴有少量的β型分生孢子;从茎秆上的病斑采集到的都是β型分生孢子;叶片上的均为α型分生孢子。各部位分生孢子形态见图1，分生孢子器形态见图2。
　　2.2 培养基的筛选 3个褐纹病菌菌株在9种培养基上的培养性状及产孢情况结果见表1，菌株生长情况结果见图3。由表1可知，能够产孢的培养基有PSA、燕麦、玉米、胡萝卜，其产孢量依次为燕麦>PSA≥玉米>胡萝卜，产孢时间除胡萝卜培养基的时间在15d以上外，其他3种培养基的产孢时间都在10d以上。由图3可知，菌丝生长较好的培养基种类有PSA、茄汁、玉米，不適合菌丝生长培养基为查彼和蛋白胨。3个菌株在不同的培养基上的菌丝生长情况存在差异，HA菌丝生长最适的培养基为茄汁培养基，HB最适的为玉米培养基，HY最适的为PSA培养基。HB在9种培养基上的菌丝生长情况总体上优于HY、HA，HA的菌丝生长为最低，在产孢情况上，3个菌株的表现较为一致。
　　3 讨论
　　茄褐纹病菌2种类型的分生孢子（β型和α型）2端的油球，已经成为Phpmopsis的分类标志。笔者在实验中观察到，α型分生孢子的油球多数情况下保持在2个（1端1个），在极少数情况下，可以观察到有3个油球存在。这一特征不仅是自然条件下形成的分生孢子，而且是人工条件下形成的分生孢子所共有的。而对于β型分生孢子，除在自然条件下较少见到外，因其不具有生殖能力，所以在一般人工培养条件下无β型分生孢子出现。目前，国内对茄褐纹病菌的分类研究仍较少，因实验采集的菌株较少，研究存在着很大的局限性，有待于进一步深入。 　　不同的褐纹病菌株在PSA培养基上的生长形态及生长速率不同，而且对于不同的菌株，最适宜生长的培养基类型也不同。菌株的致病力与其在人工条件下的生长状态无必然联系。在人工培养下，褐纹病菌的产孢能力存在明显下降现象，如何使褐纹病菌株在人工条件下较长时间的保持其在自然条件下的生活力，成为研究和保存工作的关键。罗利娟研究发现，苜蓿煎汁+Czapek培养基最有利于载孢体的产生，而OMA培养基一直都被认为是拟茎点霉属真菌产生孢子的最佳培养基，茄褐纹病菌在OMA培养基上的产孢表现优于其他培养基，但添加茄汁的培养基并不能促进褐纹病菌产孢。因本次所采用的培养基种类有限，相关研究也有待今后进一步深入。
　　4 结论
　　根据分离结果及人工培养，按照柯赫氏法则验证，从茄子病组织中分离到3个褐纹病菌株HA、HB、HY。从不同部位的病斑上采集的孢子类型不同，果实上为2种，α型和β型;叶片上为α型;茎杆上为β型。
　　PSA培养基适合作为褐纹病菌的培养使用，燕麦培养基适合作为褐纹病菌的产孢培养基和保存用。
　　参考文献
　　[1]华中农学院，东北农学院.蔬菜病理学[M].北京：中國农业出版社，1979：149-151.
　　[2]甘芳.茄子褐纹病的发生与防治[J].安徽农业，2004，4：13.
　　[3]北京农业大学.农业植物病理学[M].北京：中国农业出版社，1979：445-447.
　　[4]胡佳续，赵璟源，牛春敬，等.拟茎点霉属真菌检测技术研究进展.[J].植物检疫，2015，29（6）：16-22.
　　[5]罗利娟，习根平，姜子德，等.纯培养拟茎点霉属真菌的产孢条件[J].菌物学报，2004，23（2）：219-225.
　　[6]陈永春，姜子德，戚佩坤.RAPD分析与ITS序列分析在拟茎点霉分类鉴定上的应用[J].菌物系统，2002，21（1）：39-46.
　　[7]姜子德，梅曼彤，戚佩坤.广东果树上17种拟茎点霉的RAPD的分析[J].植物病理学报，2003，33（1）：35-39.
　　[8]周永力，吕国忠，刘伟成，等.球壳孢目真菌个体发育研究Ⅰ：壳二胞等四属[J].菌物系统，1998，17（3）：199-205.
　　[9]方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：46-49.
　　（责编：张宏民）
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